A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.
The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C. trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium’s ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.
इंट्रासेल्युलर जीवाणु क्लैमाइडिया की प्रजातियों की वजह से संक्रामक रोगों यौन संचारित रोग, श्रोणि सूजन बीमारी, अंधापन, निमोनिया और संभवतः atherosclerosis 1-4 सहित वैश्विक स्वास्थ्य पर एक बड़ा बोझ, प्रकाश में लाना। एक रिक्तिका के भीतर से, मेजबान सेल के साथ बातचीत करने के लिए क्लैमाइडिया की क्षमता (शामिल किए जाने कहा जाता है), कोशिकाओं और मेजबान के अपने सफल संक्रमण के लिए एक महत्वपूर्ण निर्धारक है। शामिल किए जाने chlamydial विकास के लिए सक्षम बनाता है और गतिशील क्लैमाइडिया 5 की पूरी 2-3 दिन विकास चक्र के दौरान संशोधित किया गया है कि एक उपन्यास रोगजनक कम्पार्टमेंट है। chlamydiae की लाचार इंट्रासेल्युलर प्रकृति सीधे शामिल किए जाने की अनूठी जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए विशेष रूप से अनुसंधान समुदाय के लिए कई चुनौतियों प्रस्तुत करता है। एक बड़ी बाधा कुशलता इंट्रासेल्युलर क्लैमाइडिया या फ्लोरोसेंट दृष्टिकोण से उनके शामिल किए जाने या तो कल्पना करने में असमर्थता कर दिया गया हैजीवित कोशिकाओं में ते। हाल ही में एक खोज अंत में GFP सी व्यक्त उत्पन्न करने के लिए साधन से पता चला है ट्रैकोमैटिस 6; हालांकि, यह निष्कर्ष अभी तक शामिल किए जाने की विशिष्ट लेबलिंग करने के लिए नेतृत्व नहीं किया है। कुछ तकनीकों बैक्टीरिया और समावेशन 7.8 की लेबलिंग के लिए वर्णित किया गया है, लेकिन वे इस तरह के photobleaching के लिए गैर विशिष्टता, भंगुरता और संवेदनशीलता के रूप में कमियों से ग्रस्त हैं। हमारे समूह द्वारा एक महत्वपूर्ण खोज मेजबान कोशिकाओं 9 व्यक्त GFP का उपयोग कर शामिल किए जाने रोशन के लिए एक नई रणनीति की स्थापना की। इस रणनीति के तर्क से अधिक से अधिक 520 से दा 10 अणुओं को शामिल किए जाने की झिल्ली की आंतरिक अछिद्रता कारनामे। कोशिकाओं स्थिरतापूर्वक एक विशेष साइटोसोलिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे, GFP या mCherry) को व्यक्त करने के लिए इंजीनियर हैं, क्लैमाइडिया समावेशन प्रतिदीप्ति की उनकी पूरी बहिष्कार से उल्लेखनीय स्पष्टता के साथ दिखाई दे रहे हैं। इस रिवर्स इमेजिंग रणनीति सभी Chl के लिए समावेशन के तत्काल दृश्य में सक्षम बनाता हैamydia प्रजातियों और यह आसानी से ब्याज की सबसे मेजबान कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसकी उपयोगिता के एक प्रदर्शन के रूप में, इस विधि क्लैमाइडिया एसपीपी 9 के लिए सेलुलर बाहर निकलने के रास्ते का पता चलता है और परिभाषित करने के लिए पहले से इस्तेमाल किया गया था।
यहाँ, हम आगे इस विधि से किया जाता है, और शामिल किए जाने के विकास की गतिशीलता के बारे में महत्वपूर्ण मात्रात्मक डेटा प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे प्रदर्शित करता है। इसके अलावा, यह प्रभावी ढंग से महंगा एंटीबॉडी आधारित गणन तरीकों के लिए स्थानापन्न कर सकते हैं और इस तरह क्लैमाइडिया 11 mKate2 व्यक्त के रूप में अन्य फ्लोरोसेंट लेबल, के साथ मिलकर में इस्तेमाल किया जा सकता है। उपकरण के इस शक्तिशाली संयोजन रहने वाले मेजबान कोशिकाओं के अंदर chlamydial शामिल किए जाने की झिल्ली के भौतिक गुणों के अन्वेषण के लिए सक्षम बनाता है।
यहाँ हम वास्तविक समय दृश्य और क्लैमाइडिया समावेशन के विश्लेषण के लिए फ्लोरोसेंट मेजबान कोशिकाओं को पैदा करने के लिए प्रयोगात्मक रणनीति का वर्णन है। इस रिक्तिका दृश्य दृष्टिकोण समय के साथ एकल कक्…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Ian Clarke and P. Scott Hefty for the pGFP-SW2 and pASK-GFP-mKate2-L2 plasmids, respectively. We thank Paul Miller for technical assistance and Richard Stephens for other resources. This work was funded by NIH grant AI095603 (KH).
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
Opti-Mem | Invitrogen | 31985 | |
Polybrene | Sigma | H9268 | |
0.45 µm filters | Fisher | 09-719D | |
G418 | Invitrogen | 10131 | |
HBSS | Invitrogen | 14025 | |
DMEM | Invitrogen | 11995 | |
RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | |
RPMI 1640 w/o phenol red | Cellgro | 17-105-CV | |
Penicillin G | Sigma | 13752 | |
Cycloheximide | Sigma | C7698 | |
Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
Chamber slides, Lab-Tek II | Nunc | 154526, 154534 |