ライブ初代細胞におけるG3BPストレス顆粒動態の可視化
Summary
ストレス顆粒（SGSは）失速リボ核タンパク質粒子（RNPは）、および様々なストレスに対する細胞応答において重要なを含む細胞質RNAの顆粒である。のSGのダイナミクスは、ストレス後のトランスフェクションした一次細胞内のSGのタグ付けされたコンポーネントの局在を可視化することにより、生細胞で追跡することができます。
Abstract
のSGは、特定のタンパク質成分またはポリA + mRNAの免疫染色により、細胞内で可視化することができる。 SGSは非常に動的であり、そのアセンブリと運命の研究では、ストレスに対する細胞の応答を理解することが重要です。 G3BP様のSGの重要な要素の欠乏は（に、RasGAP SH3ドメイン結合タンパク質）は、中枢神経系のマウス及び変更における発達障害につながる。生物、1缶培養一次細胞から細胞内のSGのダイナミクスを研究し、SGSにはトランスフェクトタグ付けされたコンポーネントのローカライズに従ってください。私たちは、マウス胚線維芽細胞におけるG3BP1含有のSG細胞（MEF）を観察するためにコマ撮り実験について説明します。この技術はまた、最近、これらのSGは、アルツハイマー病などの神経変性疾患の発症に形成されていることが示されたように非常に重要である、生きたニューロンにおけるG3BP含有のSGを研究するために使用することができる。このアプローチは、任意の他の細胞体及び顆粒タンパク質成分に適合し、かつ実施することができるトランスジェニック動物によると、これらの顆粒の具体的な因子の非存在下で、例えば顆粒動態のライブの研究を可能にする。
Introduction
ストレス顆粒（のSG）は、高温、酸化ストレス、低酸素症、浸透圧ショック、UV照射、グルコース欠乏、またはウイルス感染のような1環境ストレスに対する細胞防御応答として形成された非細胞質の膜状の病巣である。それらは、酸化的ストレスをトリガ亜砒酸ナトリウムのような化合物で処理することにより化学的に誘導することができる。 SGSは失速翻訳メッセンジャーリボ核タンパク質（mRNPs）を逮捕し蓄積する翻訳機構からmRNAを隔離する、2と錯体を形成し、そのアセンブリがeIF2αリン（真核生物開始因子α2）のリン酸化によって引き起こされることができます。 SGSはPボディーのようなポリソームや他の顆粒と部品を交換する動的な構造体である。彼らは、mRNAが安定な非ポリソームmRNPs 3への翻訳、再開始、劣化、またはパッケージのいずれかに分類され、処理される「トリアージセンター」を構成する。のSGの組み立てが速いbはUTより大きな顆粒に合体初期多数の小さな集合体との漸進的なプロセスである。微小管を破壊するか、安定化する化学的阻害剤の使用は、微小管ネットワークがアセンブリ、凝集および分解プロセスを含むSG動力学に必要とされることを示している。
のSGの動的アセンブリも二量体化することができ、TIA-1（T細胞内部抗原1）およびTIAR（TIA-1関連タンパク質）のような特定のRNA結合タンパク質（RNA-BP）の凝集によって促進される、SGSに4へソーム分解およびmRNAのルーティングを促進する。 G3BP（に、RasGAP SH3ドメイン結合タンパク質）は、細胞が亜ヒ酸や高温で強調しており、脱リン酸化G3BPの過剰発現がのSGアセンブリ5を誘導することができたときのSGに局在するようなRNA-BPである。
G3BPは最初に、RasGAP P（RAS-GTPアーゼ活性化タンパク質との相互作用により特徴づけられた進化的に保存されたRNA-BPである120 6）;しかし、この相互作用は、最近7を再訪した。 G3BPファミリは、2哺乳動物のメンバーは、G3BP1（G3BPと呼ばれる）とG3BP2 8が含まれています。両方のタンパク質は、細胞がストレス9に供されるのSGに共局在。正規のRNA認識モチーフ（RRM）を保存されたRNP1とRNP2モチーフにした：G3BPs N末端NTF2ドメインはプロリンリッチ（PXXP）のモチーフが続くそれらの局在やオリゴマー化に影響を与えることが示唆構成し、C末端モチーフは、RNA結合に関連付けられている、アルギニン – グリシンが豊富（RGG）のボックスが続く。興味深いことに、EGFPに融合した異なるドメインを構築することによって、タンパク質の様々な部分の分析はNTF2様ドメインおよびRNA結合ドメインは最も効率的に二量体化特性の重要性を示唆し、前記SGsに動員し、RNAが結合であることを示したのSGの組み立て。多様なモデルは、in vitro 10-13 に G3BPタンパク質の異なる機能を明らかにした。マウスにおけるG3BPの破壊は、発生、成長および生存14、並びに、空間ワーキングメモリ15に運動失調および欠陥を特徴と中枢神経系（CNS）におけるG3BPの重要な役割におけるこのタンパク質の重要性を示している。 G3BP欠乏は、SGの形成と神経変性疾患15の間の直接リンクを確立、変更された神経可塑性およびカルシウム恒常性につながる。それは、神経細胞のような初代細胞内のSGのダイナミクスを研究することができることが重要である。
このプロトコルは、亜ヒ酸の治療を受け、一次細胞でG3BP1含有のSGの組み立てを観察する簡単な方法を提供します。これは、応力の異なる種類、例えば、異なる条件下でのSGアセンブリを研究するために使用することができる。また、他のSGの顆粒または他の成分に適合させることができる。実際、このプロトコルは、G3BP1に焦点を当てていますが、TIA-1 / R、TTP（tristetraprolin）2のような他のストレス顆粒マーカーがありますFMRP（脆弱X精神遅滞症候群タンパク質）16、TDP-43（transactive応答DNA結合タンパク質43）17またはスタウフェン18。具体的には、TIA-1 / Rのようなタンパク質が過剰発現された場合、異なる形成のSG機能、調節および関連する転写産物が異なる場合であっても、アセンブリのSGを誘導することができるRNA結合タンパク質、核、G3BPのようである。のSGのこれらの重要な構成要素のいずれか、または核生成の発蛍光タグ付きバージョンのトランスフェクションは、画像の特定のSGアセンブリとダイナミクスに行うことができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロトコルの懸念の中で最も重要なステップ慎重に細胞毒性をダウン下げるために監視されなければならないトランスフェクション、より詳細には、時間の経過合併。
初代細胞の培養物であれば無菌状態が維持され、注意が切開および細胞分離ステップ中の損傷を防止するためにとられているように、困難な部分ではない。 MEFを初期の継代で凍結保存することができる?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、買収が行われたモンペリエリオ映像法（MRI）のプラットフォームを承認したいと思います。これらはプロトコルのさまざまな部分で彼らの助けのためにイザベルクリスティーナ·ロペスメヒア、アレクサンドラメッツ、イリーナLassot、ソランジュDesagher、ファビアンLoustalotとヴィルジニーGeorgetに感謝します。この作品は、LAルシェルシュMédicale（FRM）（エキップFRM 2011-N°DEQ20111223745）を注ぐ財団によってサポートされていました。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM/F12 | Gibco | 21331 | Pre-warm at 37 °C |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| Non essential amino acids | Gibco | 11140 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | |
| Trypsin | Gibco | 15096 | |
| Glass bottom B-35 | Greiner | 627860/627861 | Treated or not (treated: increases attachment of adherent cells) |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| DMEM | Gibco | 31966 | Pre-warm at 37 °C |
| HeBS | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103 | Pre-warm at 37 °C |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350 | |
| Forceps | Biotek | DU-110-A | Very thin, tips 0,1 mm (useful to remove meninges) |
| Curved forceps | Biotek | P-110-BUF | Very thin, tips 0,1 mm |
| Small scissors | Biotek | CM-85-BS | Can be useful to remove hippocampi |
| Polyplus transfection JetPEI reagent | Ozyme | 101-10 | MEFs transfection, follow the forward protocol |
| Inverted laser scanning confocal microscope | Leica | SP5 |
Riferimenti
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