Granuli di stress (SGS) sono granuli citoplasmatici RNA contenenti particelle in fase di stallo ribonucleoproteiche (RNP), e importante nella risposta cellulare alle varie sollecitazioni. Dinamica di SG possono essere seguite in cellule vive visualizzando la localizzazione di un componente taggato di SG in cellule primarie transfettate dopo stress.
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Articolo metodologico
Visualizzazione dei G3BP stress Granuli Dynamics in cellule primarie in diretta
In questo articolo
Sommario
Abstract
SGs può essere visualizzato in cellule mediante immunocolorazione delle componenti proteici specifici o polyA + mRNA. SG sono altamente dinamico e lo studio del loro assemblaggio e il destino è importante per capire la risposta cellulare allo stress. Il deficit dei fattori chiave della SG come G3BP (RasGAP SH3 dominio Binding Protein) porta a difetti dello sviluppo in topi e alterazioni del Sistema Nervoso Centrale. Per studiare la dinamica di SG in cellule di un organismo, si può cellule primarie di cultura e seguire la localizzazione di un componente etichettato transfettate di SGS. Descriviamo esperimento di time-lapse per osservare-G3BP1 contenente SG in fibroblasti embrionali di topo (MEF). Questa tecnica può anche essere usato per studiare SGS-G3BP contenente neuroni in vivo, che è cruciale come è stato recentemente dimostrato che questi SGs si formano alla insorgenza di malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer. Questo approccio può essere adattato a qualsiasi altro componente corpo cellulare e proteine granuli, ed eseguitocon animali transgenici, permettendo lo studio vivo di granulati dinamiche per esempio in assenza di un fattore specifico di questi granuli.
Introduzione
Granuli di stress (SGS) sono non-membranosa foci citoplasmatica formata come una risposta protettiva cellulare a stress ambientali, come la temperatura elevata, stress ossidativo, ipossia, shock osmotico, irradiazione UV, deprivazione di glucosio, o infezione virale 1. Essi possono essere indotti chimicamente mediante trattamento con composti come arsenito di sodio, che innesca lo stress ossidativo. SG accumulano in fase di stallo traduzione arrestato messaggero ribonucleoproteina (mRNPs) Complessi 2, sequestrando mRNA dal macchinario traslazionale, e il loro montaggio può essere attivato dalla fosforilazione di eIF2α (fattore di iniziazione euc....
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Protocollo
Tutte le procedure sugli animali in questo protocollo sono in stretta aderenza con le linee guida della Direttiva del Consiglio della Comunità Europea del 24 novembre 1986 (86-609/EEC). Casa dei topi in gruppo, permettendo cibo e acqua ad libitum. Mantenerle in un ambiente controllato (22 ± 1 ° C, 55 ± 5% di umidità), con una 12 ore: 12 ore di luce: ciclo di buio (luce alle 07:00).
1 Culture di cellule murine primari:. Fibroblasti embrionali di topo (MEF)
- Autoclave pinze sottili, così come pinze curve e forbici dissezione. Conservare in un contenitore sterile. Utilizzare sterile D-PBS (Dulbecco Phosphate-Buffered Salin....
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Risultati
Formazione stress granulo è importante nella risposta delle cellule allo stress, permettendo un adattamento cellulare con traduzione in stallo, finché lo stress ha autorizzato, associata alla prevenzione dell'apoptosi. Permette questo test per studiare SGS in cellule primarie, seguendo la localizzazione delle principali componenti proteiche SGS (Figura 1). G3BP, un fattore chiave di montaggio SGS, è presente piuttosto diffusamente nel citoplasma di MEF coltivate o neuroni (Figura 2A A
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Discussione
I passaggi più critici del protocollo riguardano la trasfezione e più in particolare le acquisizioni lasso di tempo, che devono essere attentamente monitorati al fine di abbassare la citotossicità.
Coltura di cellule primarie non è una parte difficile, finché le condizioni sterili sono mantenute e cautela è presa per evitare danni durante le fasi di dissezione e dissociazione cellulare. MEF può essere mantenuto congelato alle brevi passaggi. Neuron trasfezione con fosfato di calcio ha dimost.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare la piattaforma Montpellier Rio Imaging (MRI) in cui sono state effettuate le acquisizioni. Ringraziano Isabel Cristina Lopez Mejia, Alexandra Metz, Irina Lassot, Solange Desagher, Fabien Loustalot, e Virginie Georget per il loro aiuto in diverse parti del protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondation pour la Recherche Médicale (FRM) (Equipe FRM 2011-n ° DEQ20111223745).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 | Gibco | 21331 | Preriscaldamento a 37 gradi C |
| Piruvato di sodio | Gibco | 11360 | |
| Aminoacidi non essenziali | Gibco | 11140 | |
| L-Glutammina | Gibco | 25030 | |
| Tripsina | Gibco | 15096 | |
| Fondo di vetro B-35 | Greiner | 627860/627861 | Trattato o no (trattato: aumenta l'adesione delle cellule aderenti) |
| Poli-L-lisina | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| DMEM | Gibco | 31966 | Preriscaldamento a 37 ° C |
| HeBS | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| Gibco | neurobasale | 21103 | Preriscaldare a 37 gradi; C |
| 2-mercaptoetanolo | Gibco | 31350 | |
| Pinze | Biotek | DU-110-A | Molto sottile, punte 0,1 mm (utili per rimuovere le meningi) |
| Pinze curve | Biotek | P-110-BUF | Molto sottile, punte 0,1 mm |
| Forbici piccole | Biotek | CM-85-BS | Può essere utile per rimuovere ippocampi |
| Polyplus trasfezione Reagente JetPEI | Trasfezione Ozyme | 101-10 | MEF, seguire il protocollo diretto |
| Microscopio confocale a scansione laser invertita | Leica | SP5 |
Riferimenti
- Thomas, M. G., Loschi, M., Desbats, M. A., Boccaccio, G. L. RNA granules: The good, the bad and the ugly. Cellular Signalling. 23 (2), 324-334 (2011).
- Kedersha, N., Anderson, P. Stress granules: sites of mRNA triage that regulate mRNA stability and trans....
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Ristampe e permessi
