Visualização de G3BP Estresse grânulos Dynamics em pilhas ao vivo
Summary
Grânulos de estresse (SGs) são grânulos de RNA citoplasmático contendo partículas paralisadas ribonucleoproteínas (RNPs), e importante na resposta celular a várias tensões. Dinâmica da SGS pode ser seguido em células vivas, visualizando a localização de um componente marcado da SGS em células primárias transfectadas após o estresse.
Abstract
A SGS pode ser visualizada nas células por imunocoloração de componentes protéicos específicos ou poli + mRNAs. SG são altamente dinâmico e o estudo da sua montagem e o destino é importante entender a resposta celular ao stress. A deficiência em fatores-chave da SGS como G3BP (RasGAP SH3 domínio Binding Protein) leva a defeitos de desenvolvimento em ratos e alterações do Sistema Nervoso Central. Para estudar a dinâmica da SGS em células de um organismo, pode-se pilhas de cultura e seguir a localização de um componente marcado transfectadas da SGS. Descrevemos experiência de lapso de tempo para observar contendo G3BP1 SGS em rato embrionárias fibroblastos (MEFs). Esta técnica também pode ser usada para estudar SGs contendo G3BP em neurónios vivos, o que é fundamental, uma vez que foi demonstrado recentemente que estes SG são formadas no aparecimento de doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer. Esta abordagem pode ser adaptada a qualquer outro componente do corpo celular e de proteína de grânulo, e realizadacom animais transgénicos, que permite o estudo directo de grânulos, por exemplo, a dinâmica na ausência de um factor específico destes grânulos.
Introduction
Grânulos de estresse (SGs) são focos citoplasmática não-membranoso formado como uma resposta protetora celular ao estresse ambiental, tais como temperatura elevada, estresse oxidativo, hipóxia, choque osmótico, a irradiação UV, a privação de glicose, ou infecção viral 1. Eles podem ser quimicamente induzida por tratamento com compostos como o arsenito de sódio, o que desencadeia o stress oxidativo. SG acumular tradução preso parado mensageiro ribonucleoprotein (mRNPs) complexos 2, sequestrando mRNAs da maquinaria de tradução, e sua montagem pode ser desencadeada pela fosforilação de eIF2α (fator de iniciação eucariótico 2 α). SG são estruturas dinâmicas que trocar componentes com os polissomos e outros grãos, como os corpos P. Eles constituem um "centro de triagem", onde mRNAs são classificadas e processadas para qualquer tradução, reinício, degradação, ou embalagem em estáveis mRNPs não polissomal 3. A montagem da SGS é rápido but é um processo gradual, com vários pequenos agregados iniciais que se aglutinam em grânulos maiores. O uso de inibidores químicos que perturbam ou estabilizar os microtúbulos mostra que é necessária a rede de microtúbulos para a dinâmica de SG, incluindo os processos de montagem, desmontagem e coalescência.
O conjunto dinâmico de SG é também promovida pela agregação de proteínas de ligação a ARN específicas (RNA-BP) como TIA-1 (células T interna antigénio-1) e TIAR (proteína relacionada com o TIA-1), que são capazes de formar dímeros e promover polysome desmontagem e encaminhamento de mRNAs em SG 4. G3BP (proteína de ligação de domínio SH3 RasGAP) é um tal ARN-PA que se localiza SGs, quando as células são forçadas a arsenito ou a alta temperatura, e a sobre-expressão de G3BP desfosforilado pode induzir GV de montagem 5.
G3BP é um evolutivamente conservada RNA-BP que foi inicialmente caracterizado através de sua interação com uma proteína ativando-Ras GTPase (RasGAP p120 6); mas esta interação foi recentemente revisitou 7. A família G3BP inclui dois membros em mamíferos, G3BP1 (referido como G3BP) e G3BP2 8. Ambas as proteínas colocalize em SGs, quando as células são submetidas a tensão 9. G3BPs compreendem um domínio N-terminal NTf 2 sugeriu a influenciar a sua localização e oligomerização, seguido pela prolina rica (PxxP) motivos, então motivos C-terminal associada com a ligação RNA: o RNA-canônico Recognition Motif (RRM) com conservadas RNP1 e RNP2 motivos , seguido de uma caixa rica arginina-glicina (RGG). Curiosamente, a análise de diferentes partes da proteína através da construção de diferentes domínios fundidos com EGFP mostrou que o domínio NTf2-like e o domínio de ligação a ARN-se o mais eficiente recrutados para SG, sugerindo a importância das propriedades de dimerização e de ligação de ARN em a montagem da SGS. Diversos modelos têm revelado diferentes funções das proteínas G3BP in vitro 10-13.Perturbação de G3BP em ratos mostraram a importância desta proteína no crescimento do desenvolvimento e sobrevivência de 14, bem como um papel importante para G3BP no Sistema Nervoso Central (SNC), caracterizada por ataxia e defeitos em espacial da memória de trabalho 15. Deficiência G3BP leva à alteração neuronal plasticidade e cálcio homeostase, estabelecer uma ligação directa entre a formação SG e doenças neurodegenerativas 15. Assim, é importante ser capaz de estudar a dinâmica da SGS em células primárias, como neurônios.
Este protocolo fornece uma maneira simples de observar a montagem de contendo G3BP1 SGS em células primárias em tratamento arsenito. Ele pode ser utilizado para estudar a montagem SG sob diferentes condições, por exemplo, diferentes tipos de stress. Ele também pode ser adaptado a outros grânulos ou outros componentes de SG. Com efeito, este protocolo incide sobre G3BP1, mas existem outros grânulos de stress como marcadores TIA-1 / R, TTP (tristetraprolin) 2,FMRP (Fragile X Retardo Mental Síndrome de proteína) 16, (proteína de ligação DNA resposta transacional 43) TDP-43 17 ou 18 Staufen. Em particular, as proteínas como TIA-1 / R são, como G3BP, proteínas de ligação de ARN de nucleação que podem induzir a montagem SGs, quando sobre-expresso, mesmo se os diferentes SGs formadas pode variar em função, regulação e transcritos associados. A transfecção de versão marcou-fluoróforo de qualquer um destes componentes-chave ou nucleadores da SGS pode ser realizada para determinada imagem montagem e dinâmica do GV.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os passos mais críticos no protocolo preocupação a transfecção e mais particularmente as aquisições lapso de tempo, que devem ser cuidadosamente monitoradas a fim de baixar a citotoxicidade.
Cultura de células primárias não é uma parte difícil, desde que sejam mantidas condições estéreis e cuidado é tomado para evitar danos durante as etapas de dissecação e de dissociação celular. MEFs pode ser mantido congelado no início passagens. Neuron transfecção com fosfato de c?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a plataforma Montpellier Rio (RM) onde foram realizadas as aquisições. Eles agradecem Isabel Cristina Lopez Mejia, Alexandra Metz, Irina Lassot, Solange Desagher, Fabien Loustalot, e Virginie Georget por sua ajuda em diferentes partes do protocolo. Este trabalho foi apoiado pela Fondation pour la Recherche Médicale (FRM) (Equipe FRM 2011-n ° DEQ20111223745).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM/F12 | Gibco | 21331 | Pre-warm at 37 °C |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| Non essential amino acids | Gibco | 11140 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | |
| Trypsin | Gibco | 15096 | |
| Glass bottom B-35 | Greiner | 627860/627861 | Treated or not (treated: increases attachment of adherent cells) |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| DMEM | Gibco | 31966 | Pre-warm at 37 °C |
| HeBS | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103 | Pre-warm at 37 °C |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350 | |
| Forceps | Biotek | DU-110-A | Very thin, tips 0,1 mm (useful to remove meninges) |
| Curved forceps | Biotek | P-110-BUF | Very thin, tips 0,1 mm |
| Small scissors | Biotek | CM-85-BS | Can be useful to remove hippocampi |
| Polyplus transfection JetPEI reagent | Ozyme | 101-10 | MEFs transfection, follow the forward protocol |
| Inverted laser scanning confocal microscope | Leica | SP5 |
Riferimenti
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