आरएनए वायरस के व्यापक स्पेक्ट्रम रासायनिक inhibitors के लिए उच्च throughput प्रदर्शन
Summary
वायरस प्रतिकृति को मापने के लिए इन विट्रो assays में बहुत luciferase या bioluminescence में सक्षम अन्य एंजाइमों व्यक्त पुनः संयोजक आरएनए वायरस के विकास से सुधार किया गया है. यहाँ हम विस्तार से खसरा और रासायनिक पुस्तकालयों से व्यापक स्पेक्ट्रम antivirals अलग करने के लिए चिकनगुनिया वायरस के ऐसे पुनः संयोजक उपभेदों जोड़ती है एक उच्च throughput स्क्रीनिंग पाइपलाइन.
Abstract
आरएनए वायरस फ्लू, ब्रोंकाइटिस, डेंगू, हेपेटाइटिस सी या खसरा के रूप में प्रमुख मानव रोगों के लिए जिम्मेदार हैं. उन्होंने यह भी है क्योंकि अधिक से अधिक प्राकृतिक पारिस्थितिक तंत्र मर्मज्ञ बढ़ दुनिया भर में बाजारों और मानव आबादी के एक उभरते खतरे का प्रतिनिधित्व करते हैं. इस तरह एक उभरती हुई स्थिति का एक अच्छा उदाहरण हिंद महासागर में 2005-2006 के चिकनगुनिया वायरस महामारी है. वायरल प्रतिकृति को नियंत्रित सेलुलर रास्ते के बारे में हमारी समझ में हाल की प्रगति मेजबान सेल कार्यों को लक्षित यौगिकों, बल्कि वायरस खुद से, आरएनए वायरस की एक बड़ी पैनल बाधित हो सकता है. कुछ व्यापक स्पेक्ट्रम antiviral यौगिकों मेजबान लक्ष्य उन्मुख assays के साथ पहचान की गई है. हालांकि, सेल संस्कृतियों में वायरल प्रतिकृति के निषेध को मापने के एक readout के रूप में कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव की कमी का उपयोग अभी भी एक सर्वोपरि स्क्रीनिंग रणनीति का प्रतिनिधित्व करता है. इस तरह कार्यात्मक स्क्रीन बहुत संवाददाता व्यक्त पुनः संयोजक वायरस के विकास से सुधार किया गया है सीए एंजाइमोंऐसे luciferase रूप bioluminescence की पाब्ले. वर्तमान रिपोर्ट में, हम विस्तार से एक व्यापक स्पेक्ट्रम एंटीवायरल प्रोफाइल के साथ यौगिकों की पहचान करने के लिए, पुनः संयोजक खसरा और सेलुलर व्यवहार्यता assays के साथ चिकनगुनिया वायरस को जोड़ती है जो एक उच्च throughput स्क्रीनिंग पाइपलाइन,.
Introduction
आरएनए वायरस मानव में संक्रमण की एक विशाल विविधता के लिए जिम्मेदार हैं, और दोनों सार्वजनिक स्वास्थ्य और किफायती लागत के मामले में दुनिया भर में आबादी पर एक बहुत बड़ा प्रभाव पड़ता है. कुशल टीके कई मानव आरएनए वायरस के खिलाफ विकसित किया गया है, और व्यापक रूप से रोगनिरोधी उपचार के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं. हालांकि, आरएनए वायरस के संक्रमण के खिलाफ चिकित्सीय औषधियों का एक महत्वपूर्ण कमी अभी भी वहाँ है. दरअसल, कुशल टीके ऐसे डेंगू वायरस, हेपेटाइटिस सी वायरस या मानव श्वसन syncytial वायरस (hRSV) के रूप में प्रमुख मानव रोगजनकों के खिलाफ उपलब्ध नहीं हैं. इसके अलावा, आरएनए वायरस की वजह से वैश्विक बाजारों और पारिस्थितिकी प्रणालियों पर मानव प्रभाव की आवृत्ति में वृद्धि हुई है, जो उभरते रोगों, के बहुमत के लिए जिम्मेदार हैं. आरएनए वायरस का प्रतिनिधित्व करते हैं कि इस खतरे के खिलाफ, हमारे चिकित्सीय शस्त्रागार अत्यंत सीमित और 1-3 अपेक्षाकृत अक्षम है. वर्तमान उपचार के अनिवार्य रूप से, जन्मजात उन्मुक्ति को प्रोत्साहित करने के लिए पुनः संयोजक प्रकार मैं इंटरफेरॉन (IFN-α / β) पर आधारित हैंया ribavirin का प्रशासन. इस ribonucleoside अनुरूप की कार्रवाई की विधा विवादास्पद है और शायद विभिन्न तंत्र पर निर्भर करता है, intracellular जीटीपी पूल depletes जो सेलुलर IMPDH (आइनोसीन मोनोफास्फेट डिहाइड्रोजनेज), के निषेध, 4 स्पष्ट रूप से आवश्यक है. Ribavirin, pegylated IFN-α के साथ संयोजन में, हेपेटाइटिस सी वायरस के खिलाफ मुख्य इलाज है. वे कुशलता से कुंद IFN-α / β 5 कारकों डाह की अभिव्यक्ति के माध्यम से संकेत और अक्सर ribavirin 3 भागने के रूप में हालांकि, IFN-α / β और ribavirin उपचार सबसे आरएनए वायरस के खिलाफ vivo में अपेक्षाकृत गरीब प्रभावकारिता के हैं. यह हाल ही में विवादास्पद लाभ 6 के साथ गंभीर hRSV रोग के खिलाफ अनुमोदित किया गया था, हालांकि यह ribavirin उपचार महत्वपूर्ण विषाक्तता मुद्दों को उठा रहा है कि इस तथ्य की गयी. हाल ही में, कुछ वायरस विशेष उपचार विकास ओ के साथ इन्फ्लूएंजा वायरस के खिलाफ विशेष रूप से, विपणन किया गया हैच neuraminidase inhibitors 3. हालांकि, बड़ी विविधता और आरएनए वायरस की स्थायी उद्भव एक अपेक्षाकृत करीब भविष्य में उनमें से हर एक के खिलाफ विशिष्ट उपचार के विकास के अलग करता है. कुल मिलाकर, यह निकट भविष्य में शक्तिशाली antiviral अणुओं की पहचान करने और विकसित करने के लिए कुशल रणनीति के लिए जरूरत पर जोर दिया.
यह आरएनए वायरस की एक बड़ी पैनल के खिलाफ सक्रिय एक व्यापक स्पेक्ट्रम अवरोध करनेवाला इस समस्या का समाधान होगा कि कहने के लिए तुच्छ है. इस तरह के एक अणु अभी भी एक virologist का सपना है, सेलुलर रक्षा तंत्र और सहज प्रतिरक्षा प्रणाली के बारे में हमारी बेहतर समझ कुछ संभावनाओं 7,8 मौजूद सुझाव है कि. कई शैक्षणिक और औद्योगिक प्रयोगशालाओं अब सेलुलर सुरक्षा तंत्र या वायरल प्रतिकृति को कुंद करने के लिए चयापचय मार्ग के विशिष्ट पहलुओं को उत्तेजित अणुओं है कि मांग कर रहे हैं. ऐसे यौगिकों शायद महत्वपूर्ण दुष्प्रभाव दिखाई देगा हालांकि, तीव्र वायरल संक्रमण के खिलाफ उपचार प्रशासन होगालंबी अवधि के बारे में कुछ संभावित विषाक्तता के बावजूद उन्हें स्वीकार्य बना रही है, एक अपेक्षाकृत कम समय के लिए एड. विभिन्न रणनीतियों ऐसे व्यापक स्पेक्ट्रम एंटीवायरल अणुओं की पहचान करने के लिए विकसित किया गया है. कुछ शोध कार्यक्रमों के विशिष्ट रक्षा या चयापचय मार्ग है कि लक्ष्य अणुओं को खोजने का उद्देश्य. यह शामिल है, उदाहरण के लिए, विषाणु जीन अभिव्यक्ति 9 बटोर और ऐसे RNaseL 10, वायरस गिरावट 11 को बढ़ावा देने के भोजी मशीनरी के रूप में एंटीवायरल कारकों को सक्रिय करने के लिए रोगज़नक़ मान्यता रिसेप्टर्स, न्यूक्लीओसाइड संश्लेषण वायरस से संक्रमित कोशिकाओं की मौत वेग 12,13, या apoptotic Cascades रास्ते 14. अन्य समूहों 13,15-17 को लक्ष्य आधारित नहीं कर रहे हैं कि प्ररूपी स्क्रीन विकसित किया है. उस मामले में, एंटीवायरल अणुओं बस एक दिया सेलुलर प्रणाली में वायरल प्रतिकृति ब्लॉक उनकी क्षमता से पहचाने जाते हैं. आम धारणा 2-3 असंबंधित आरएनए वायरस बाधा एक परिसर में एक व्यापक सपा के लिए एक उपयुक्त प्रोफ़ाइल होता हैएंटीवायरल अणु ectrum. इस तरह के एक अनुभवजन्य दृष्टिकोण के साथ चयनित हिट यौगिकों की कार्रवाई की विधा केवल एक दूसरी बार में निर्धारित किया जाता है और अंत में, antivirals के लिए उपन्यास सेलुलर लक्ष्यों की पहचान करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. दिलचस्प है, 1999 और 2008 के बीच अमेरिका के खाद्य एवं औषधि प्रशासन द्वारा अनुमोदित नई दवाओं की एक पूर्वव्यापी विश्लेषण सामान्य रूप में, इस तरह के प्ररूपी चोकर प्रथम श्रेणी में छोटे अणु दवाओं 18 को खोजने के लिए लक्ष्य आधारित दृष्टिकोण की तुलना में बेहतर प्रदर्शन करते हैं पता चला है कि .
उच्च throughput सेल आधारित assays में वायरल प्रतिकृति आमतौर पर वायरस कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव से निर्धारित होता है. कोशिकाओं को संक्रमित और सुसंस्कृत 96 में कर रहे हैं – या परीक्षण यौगिकों की उपस्थिति में 384 अच्छी तरह प्लेटें. कुछ दिनों के बाद, सेलुलर परतों तय कर रहे हैं और इस तरह के क्रिस्टल बैंगनी के रूप में रंगों के साथ दाग. अंत में, absorbance एक प्लेट रीडर और वायरल प्रतिकृति बाधा यौगिकों fro सेलुलर परतों को संरक्षित करने के लिए उनकी क्षमता से पहचाना जाता है के साथ निर्धारित किया जाता हैएम वायरस प्रेरित कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव. वैकल्पिक रूप से, virally की मध्यस्थता कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव इस तरह एमटीएस कमी के रूप में मानक व्यवहार्यता assays का उपयोग मूल्यांकन कर रहे हैं. ऐसे assays अत्यधिक विनयशील और लागत प्रभावी रहे हैं, लेकिन तीन प्रमुख सीमाओं से ग्रस्त हैं. पहला, वे इस प्रकार 19 दृष्टिकोण विकल्प के लिए बुला, वायरल प्रतिकृति केवल कुछ ही दिनों में कोशिकाविकृति संबंधी है, लेकिन यह हमेशा संभव नहीं है, जहां एक वायरस सेल संयोजन की आवश्यकता होती है. दूसरा, वे वायरल प्रतिकृति के एक अप्रत्यक्ष उपाय पर आधारित होते हैं के बाद से खराब मात्रात्मक हैं. अंत में, विषाक्त यौगिकों सकारात्मक हिट के रूप में रन बनाए जा सकते हैं, और इसलिए सेलुलर व्यवहार्यता को मापने के लिए एक काउंटर स्क्रीन के साथ समाप्त किया जाना चाहिए. इन बाधाओं के कुछ काबू पाने के लिए, पुनः संयोजक वायरस या replicons एक अतिरिक्त प्रतिलेखन इकाई से या वायरल प्रोटीन जीन (कुछ उदाहरण 20-23 कर रहे हैं) के साथ फ्रेम में, इस तरह के EGFP या luciferase रूप संवाददाता प्रोटीन, व्यक्त करने के लिए रिवर्स आनुवंशिकी द्वारा अंजाम दिया गया है. इन वायरस को दोहराने जब, संवाददाता जनसंपर्कoteins वायरल प्रोटीन के साथ खुद को एक साथ उत्पादन कर रहे हैं. इस वायरल प्रतिकृति को मापने और उम्मीदवार अणुओं की निरोधात्मक गतिविधियों का मूल्यांकन करने के लिए एक बहुत मात्रात्मक परख प्रदान करता है. यह इस संवाददाता प्रणाली एक उच्च संवेदनशीलता और वास्तव में कोई पृष्ठभूमि के साथ एक व्यापक गतिशील रेंज दर्शाती के बाद luciferase (या bioluminescence में सक्षम अन्य एंजाइमों) व्यक्त पुनः संयोजक वायरस के लिए विशेष रूप से सच है. इसके अलावा, कोई उत्तेजना प्रकाश स्रोत इस प्रकार यौगिक प्रतिदीप्ति 24 के साथ हस्तक्षेप को रोकने है.
यहाँ, हम विस्तार एक उच्च throughput प्रोटोकॉल आरएनए वायरस की व्यापक स्पेक्ट्रम inhibitors के लिए रासायनिक पुस्तकालयों स्क्रीन करने के लिए. यौगिकों जुगनू luciferase 25 (rMV2/Luc, चित्रा 1, प्राथमिक स्क्रीन) व्यक्त एक पुनः संयोजक खसरा वायरस (एमवी) से संक्रमित मानव कोशिकाओं पर पहले जांच की जाती है. एमवी क्रम Mononegavirales के अंतर्गत आता है, और अक्सर नकारात्मक कतरा आरएनए वायरस का एक प्रोटोटाइप सदस्य के रूप में माना जाता हैतों. जैसे, एमवी जीनोम वायरल प्रोटीन के लिए एन्कोडिंग mRNA अणुओं synthesize करने के लिए वायरल पोलीमर्स द्वारा टेम्पलेट के रूप में प्रयोग किया जाता है. RMV2/Luc बुलाया पुनः संयोजक एम वी तनाव में, luciferase अभिव्यक्ति पी और एम जीन (2A चित्रा) के बीच डाला एक अतिरिक्त प्रतिलेखन इकाई से व्यक्त किया है. समानांतर में, यौगिकों एटीपी मात्रा का ठहराव से, मूल्यांकन करता है कि एक वाणिज्यिक luciferase आधारित अभिकर्मक का उपयोग मानव कोशिकाओं पर उनकी विषाक्तता के लिए परीक्षण कर रहे हैं, संस्कृति में metabolically सक्रिय कोशिकाओं की संख्या (चित्रा 1, प्राथमिक स्क्रीन). पूरे रासायनिक पुस्तकालयों आसानी से विषाक्त नहीं हैं और कुशलतापूर्वक एमवी प्रतिकृति ब्लॉक कि यौगिकों का चयन करने के क्रम में इन दो assays के साथ जांच की जा सकती है. फिर, हिट चिकनगुनिया वायरस (CHIKV) प्रतिकृति (चित्रा 1, माध्यमिक स्क्रीन) ख़राब उनकी क्षमता के लिए खुराक प्रतिक्रिया एमवी प्रतिकृति का निषेध, विषाक्तता की कमी के साथ ही के लिए पुनर्परीक्षण कर रहे हैं. CHIKV Togaviridae परिवार का एक सदस्य है और उसके जीनोम एपी हैositive एकल कतरा शाही सेना अणु. जैसे, यह खसरा और एमवी और CHIKV दोनों आरएनए वायरस की एक बड़ी पैनल को बाधित करने के लिए एक बहुत अच्छा मौका खड़े बाधा यौगिकों के लिए पूरी तरह से असंबद्ध है. संरचनात्मक प्रोटीन प्रतिलेखन और एक subgenomic mRNA अणु का अनुवाद द्वारा इनकोडिंग हैं जबकि CHIKV nonstructural प्रोटीन सीधे, वायरल जीनोम से अनुवाद कर रहे हैं. CHIKV के लिए हमारे में इन विट्रो प्रतिकृति परख nsP3 और NSP4 दृश्यों 26 (चित्रा 2 बी) के बीच रिपोर्टर जीन की एक प्रविष्टि के माध्यम से nonstructural polyprotein की एक cleaved भाग के रूप में Renilla luciferase एंजाइम व्यक्त करता है जो CHIKV / रेन नामक एक पुनः संयोजक तनाव, पर आधारित है. Renilla luciferase गतिविधि के उपाय CHIKV जीवन चक्र के प्रारंभिक चरण में वायरल प्रतिकृति की निगरानी की अनुमति देता है.
इस उच्च throughput प्रोटोकॉल जल्दी से 10,000 molec के एक वाणिज्यिक पुस्तकालय में व्यापक स्पेक्ट्रम antivirals के लिए एक उपयुक्त प्रोफाइल के साथ यौगिकों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया थाules रासायनिक विविधता के लिए समृद्ध. यौगिकों अनिवार्य रूप से 250 से 600 डाल्टन को लेकर आणविक वजन के साथ, पांच की Lipinski के नियम का पालन, और नीचे 5 डी मूल्यों लॉग इन कर रहे थे. इन अणुओं के अधिकांश अन्य वाणिज्यिक पुस्तकालयों में उपलब्ध नहीं नए रासायनिक संस्थाओं थे.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ वर्णित स्क्रीनिंग पाइपलाइन आरएनए वायरस की व्यापक स्पेक्ट्रम inhibitors के रूप में एक उपयुक्त प्रोफाइल के साथ यौगिकों का चयन करना है. 10,000 यौगिकों का एक पुस्तकालय इस प्रोटोकॉल और aforementioned फ़िल्टरिंग मापदंड ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम अपने उपयोगी टिप्पणियों और सुझावों के लिए डॉ. यवेस एल Janin धन्यवाद. हम उसे तकनीकी समर्थन के लिए CHIK / रेन और सी. Combredet के लिए एच एच गाद को धन्यवाद देना चाहूंगा. पाश्चर बुराइयों Infectieuses (पीओवी के लिए कार्यक्रम डंक और एचएम – यह काम Institut पाश्चर, केंद्र में राष्ट्रीय डी ला Recherche Scientifique (CNRS) Institut राष्ट्रीय डे ला Sante एट डी ला Recherche médicale (INSERM), Institut कार्नोट द्वारा समर्थित किया गया एल), एजेंस नेशनल ला Recherche पीओवी के लिए (ANR-RPIB, कार्यक्रम डंक 2.0), और "Conseil क्षेत्रीय डी 'Ile-de-फ्रांस" (रासायनिक लाइब्रेरी प्रोजेक्ट डालना, अनुदान n मैं 06-222 / आर ° और मैं एचएम-एल 09-1739 / आर.). CHIKV / रेन पर काम परियोजना ArbOAS द्वारा समर्थित किया गया (ANR अनुदान 2010-INTB-1601-02).
Materials
| Freedom EVO platform | TECAN | Robotic platform | |
| 96-Well Polystyrene Cell Culture Microplates, White | Greiner Bio One | 655083 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | Luciferase-based viability assay |
| Bright-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2610 | Reagent containing firefly luciferase substrate |
| Renilla-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2710 | Reagent containing Renilla luciferase substrate |
| Britelite plus Reporter Gene Assay System | Perkin-Elmer | 6016761 | Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity |
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