High-throughput Screening for Bredspektret Chemical hæmmere af RNA virus

Summary

In vitro assays til at måle virus replikation er blevet kraftigt forbedret gennem udvikling af rekombinante RNA-virus, der udtrykker luciferase eller andre enzymer, der kan bioluminescens. Her har vi detalje en high-throughput screening rørledning, der kombinerer disse rekombinante stammer af mæslinger og Chikungunya virus at isolere bredspektrede antivirale fra kemiske biblioteker.

Abstract

RNA-virus er ansvarlig for større menneskelige sygdomme som influenza, bronkitis, denguefeber, Hepatitis C eller mæslinger. De repræsenterer også en ny trussel på grund af øgede verdensomspændende udvekslinger og befolkningsgrupper gennemtrængende flere og flere naturlige økosystemer. Et godt eksempel på en sådan en spirende situation Chikungunyavirus epidemier af 2005-2006 i Det Indiske Ocean. Nylige fremskridt inden for vores forståelse af cellulære mekanismer, der styrer virusreplikation tyder på, at stoffer til værten cellefunktioner, snarere end selve virus, kunne hæmme et stort panel af RNA-virus. Nogle bredspektrede antivirale forbindelser er blevet identificeret med værten målrettede analyser. Men måling af inhiberingen af ​​viral replikation i cellekulturer ved hjælp af reduktion af cytopatiske virkninger som en udlæsning stadig et altoverskyggende screening strategi. Sådanne funktionelle skærme er blevet kraftigt forbedret gennem udviklingen af ​​rekombinante vira, der udtrykker reporterenzymer capable af bioluminescens, såsom luciferase. I nærværende rapport, vi detalje en high-throughput screening rørledning, som kombinerer rekombinante mæslinger og Chikungunya virus med cellulær levedygtighed assays til at identificere forbindelser med en bredspektret antiviral profil.

Introduction

RNA-virus er ansvarlig for en lang række infektioner hos mennesker, og har en enorm indflydelse på befolkningerne i hele verden, både hvad angår den offentlige sundhed og økonomiske omkostninger. Effektive vacciner er blevet udviklet mod flere humane RNA-virus, og er almindeligt anvendt som profylaktiske behandlinger. Imidlertid er der stadig en kritisk mangel på terapeutiske lægemidler mod RNA-virus-infektioner. Faktisk effektive vacciner er ikke tilgængelige mod større humane patogener som dengue-virus, Hepatitis C virus eller humant respiratorisk syncytialvirus (HRSV). Udover, RNA-virus er ansvarlige for størstedelen af ​​nye sygdomme, som er steget i hyppighed på grund af den globale børser og menneskets påvirkning af økologiske systemer. Mod denne trussel, der repræsenterer RNA-vira, vores terapeutiske arsenal er yderst begrænset og relativt ineffektive ^1-3. Nuværende behandlinger er hovedsagelig baseret på rekombinant type I interferoner (IFN-α / β) for at stimulere medfødte immunitet,eller administration af ribavirin. Selvom virkningsmekanismen af denne ribonucleosid analog er kontroversiel og formentlig beror på forskellige mekanismer, hæmning af cellulær IMPDH (inosinmonofosfatdehydrogenase), der udtømmer intracellulære GTP puljer, er helt klart afgørende ^4.. Ribavirin i kombination med pegyleret IFN-α, er den vigtigste behandling mod hepatitis C-virus. Men IFN-α / β og ribavirin behandlinger er af forholdsvis ringe effektivitet in vivo mod de fleste RNA-vira, som de effektivt stump IFN-α / β signalering gennem ekspression af virulensfaktorer ⁵ og ofte undslippe ribavirin ^3. Det tilføjes, at ribavirin er at hæve vigtige spørgsmål toksicitet, selv om det for nylig blev godkendt mod alvorlig HRSV sygdom med kontroversielle fordele ^6.. For nylig har nogle virus-specifikke behandlinger blevet markedsført, især mod influenzavirus med udviklingen of neuraminidasehæmmere ^3. Men den store mangfoldighed og permanente fremkomst af RNA-vira til hinder for udviklingen af ​​specifikke behandlinger mod hver af dem i en forholdsvis tæt fremtid. Tilsammen understreger dette behovet for effektive strategier til at identificere og udvikle potente antivirale molekyler i den nærmeste fremtid.

Det er trivielt at sige, at et bredt spektrum inhibitor aktive mod et stort panel af RNA-vira ville løse dette problem. Selv om et sådant molekyle er stadig en virusspecialist drøm, vores bedre forståelse af cellulære forsvarsmekanismer og medfødte immunsystem tyder på, at nogle muligheder eksisterer ^7,8. Flere akademiske og industrielle laboratorier søger nu molekyler, der stimulerer bestemte facetter af cellulære forsvarsmekanismer eller metaboliske veje til at sløve viral replikation. Selv om sådanne forbindelser, der sandsynligvis vil vise betydelige bivirkninger, vil behandlinger mod akutte virusinfektioner være administrereed for en relativ kort tid, hvilket gør dem acceptable trods nogle potentielle toksicitet på lang sigt. Forskellige strategier er blevet udviklet til at identificere sådanne bredspektrede antivirale molekyler. Nogle forskningsprogrammer sigter mod at finde molekyler, der er målrettet specifikke veje forsvar eller metabolisk. Dette omfatter for eksempel patogen anerkendelse receptorer fremkalder antiviral genekspression ⁹ og aktiverer antivirale faktorer såsom RNaseL ¹⁰ autofagi maskiner til fremme af virus nedbrydning ¹¹ nukleosidsyntesen pathways ^12,13 eller apoptotiske kaskader at udfælde død virusinficerede celler ^14.. Andre grupper har udviklet fænotypiske skærme, der ikke målrette-baserede ^13,15-17. I så fald er antivirale molekyler simpelthen identificeres ved deres evne til at blokere viral replikation i et givet cellulært system. Den generelle antagelse er, at en forbindelse, hæmme 2-3 uafhængige RNA-vira ville have en passende profil til et bredt spectrum antiviralt molekyle. Virkningsmekanismen hit forbindelser udvalgt med sådan en empirisk tilgang alene bestemmes i en anden tid og i sidste ende kan føre til identifikation af nye cellulære mål for antivirale lægemidler. Interessant nok har en retrospektiv analyse af nye lægemidler, der er godkendt af den amerikanske Food and Drug Administration mellem 1999 og 2008 vist, at i almindelighed, sådan fænotypiske screeninger har tendens til at klare sig bedre end målrettede tilgange til at opdage first-in-class lille molekyle narkotika ¹⁸ .

Viral replikation i high-throughput cellebaserede assays bestemmes normalt ud fra virus cytopatiske effekter. Celler inficeret og dyrket i 96 – eller 384-brønds plader i nærværelse af testede forbindelser. Efter nogle dage, cellulære lag fikseres og farves med farvestoffer, såsom krystalviolet. Endelig er absorbans bestemmes med en plade læser og forbindelser hæmmer viral replikation identificeres ved deres evne til at bevare cellulære lag from virus-induceret cytopatisk virkning. Alternativt viralt medierede cytopatiske virkninger bedømmes under anvendelse af standard levedygtighed assays, såsom MTS reduktion. Sådanne assays er meget medgørlig og omkostningseffektiv, men lider tre store begrænsninger. Først, de kræver et virus-celle kombination hvor viral replikation er cytopatisk på kun få dage, men det er ikke altid muligt, og dermed opfordrer til alternative tilgange ^19. For det andet er de dårligt kvantitativ da de er baseret på et indirekte mål for viral replikation. Endelig kan giftige forbindelser blive scoret som positive hits, og derfor skal fjernes med en tæller skærm måler cellulær levedygtighed. For at overvinde nogle af disse forhindringer har rekombinante vira eller replikoner blevet manipuleret af revers genetik til at udtrykke reporter-proteiner, såsom EGFP eller luciferase fra en yderligere transkriptionsenhed eller i ramme med virale protein-gener (få eksempler ^20-23). Når disse vira kopiere, reporter PRoteins produceres sammen med virale proteiner selv. Dette giver en meget kvantitativ analyse for at måle viral replikation og evaluere den inhibitoriske aktivitet af kandidatmolekyler. Dette er især tilfældet for rekombinante vira, der udtrykker luciferase (eller andre enzymer, der kan bioluminescens), eftersom dette reportersystem udviser et bredt dynamikområde med en høj følsomhed og næsten ingen baggrund. Desuden er der ingen excitationslyskilde, hvilket forhindrer interferens med forbindelse fluorescens ^24.

Her har vi detalje en high-throughput-protokollen til at screene kemiske biblioteker for bredspektrede inhibitorer af RNA-virus. Forbindelser testes først på humane celler inficeret med et rekombinant mæslingevirus (MV), der udtrykker ildflueluciferase ²⁵ (rMV2/Luc, figur 1, den primære skærm). MV tilhører Mononegavirales orden, og er ofte betragtes som et prototypisk medlem af negativt-strenget RNA-viruses. Som sådan er MV-genomet anvendt som en template med viruspolymerasekomplekset til syntese af mRNA-molekyler, der koder for virale proteiner. I den rekombinante MV stamme kaldet rMV2/Luc er luciferaseekspression udtrykkes fra en yderligere transkriptionsenhed indsættes mellem P-og M-gener (figur 2A). Sideløbende er forbindelser testet for deres toksicitet på humane celler ved hjælp af en kommerciel luciferase-baserede reagens, der vurderer, af ATP kvantificering, antallet af metabolisk aktive celler i kultur (figur 1, den primære skærm). Hele kemiske biblioteker kan let screenes med disse to analyser for at udvælge forbindelser, der ikke er toksiske og effektivt blokerer MV replikation. Derefter hits testes igen for dosis-respons-hæmning af MV replikation, mangel på toksicitet såvel som for deres evne til at forringe Chikungunya virus (CHIKV) replikation (figur 1, sekundær skærm). CHIKV er medlem af Togaviridae familien og dens genom er APositive enkeltstrenget RNA-molekyle. Som sådan, det er helt uden forbindelse med mæslinger og forbindelser hæmmer både MV og CHIKV stå en stor chance for at hæmme et stort panel af RNA-virus. CHIKV strukturelle proteiner er direkte oversat fra det virale genom, mens de strukturelle proteiner kodes af transkription og translation af en subgenomiske mRNA-molekyle. Vores replikation in vitro assay for CHIKV er baseret på en rekombinant stamme kaldet CHIKV / Ren, der udtrykker Renilla luciferase enzym som en spaltet del af det ikke-strukturelle polyprotein ved en insertion af reportergenet mellem NSP3 og nsP4 sekvenser ²⁶ (figur 2B). Målestokken for Renilla luciferaseaktivitet tillader overvågning af viral replikation på det tidlige stadium af CHIKV livscyklus.

Denne high-throughput protokol blev anvendt til hurtigt at identificere forbindelser med en passende profil til bredspektrede antivirale i en kommerciel bibliotek på 10.000 MolecESTEMMELSER beriget for kemisk mangfoldighed. Forbindelser blev hovedsagelig følgende Lipinski herredømme af fem, med molekylvægt, der varierer fra 250 til 600 dalton, og log D-værdier under 5. De fleste af disse molekyler var nye kemiske enheder, der ikke er tilgængelige i andre kommercielle biblioteker.

Protocol

1. Fremstilling af 96-brønds afledte Plader med forbindelser Flyt 96-brønds mor-plader indeholdende 10 mM stamopløsninger af kemiske forbindelser i DMSO fra -20 ° C til stuetemperatur. Fortyndede forbindelser 5x i DMSO til opnåelse af mellemprodukter 96-brønds fortynding plader ved 2 mM. Fortynding er opnået ved at pipettere fem pi i 20 pi DMSO og blanding. Afpipetteres 1 pi fra fortynding plader i tørre brønde hvidt, stregkode vævsdyrkningsplader med 96 brønde. Dette første sæt af datt…

Representative Results

Denne screening rørledning er først om udvælgelse af stoffer, som hæmmer MV replikation og viser ikke nogen signifikant cellulær toksicitet (figur 1, den primære skærm). Det drager fordel af luciferase-assays til at bestemme cellulær toksicitet og inhibering af viral replikation. Alle pipetteringstrin og dataopsamling kan udføres i en high-throughput indstilling med en robot platform. Cellulær toksicitet af forbindelserne vurderes ved anvendelse af en luciferase-ba…

Discussion

Screeningen pipeline her beskrevet sigter mod at udvælge forbindelser med en passende profil som bredspektrede inhibitorer af RNA-virus. Når et bibliotek på 10.000 forbindelser blev screenet med denne protokol og førnævnte filtrering kriterier blev anvendt, dvs hæmning af MV replikation overlegen til 75%, 40 forbindelser (0,4%) scorede positiv. Udover, omkring halvdelen af ​​dem viste nogle toksicitet i luciferase-baserede levedygtighedsassay, og blev der set bort af denne grund. Endelig blev et dusin…

Materials

Freedom EVO platform	TECAN		Robotic platform
96-Well Polystyrene Cell Culture Microplates, White	Greiner Bio One	655083
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay	Promega	G7570	Luciferase-based viability assay
Bright-Glo Luciferase Assay System	Promega	E2610	Reagent containing firefly luciferase substrate
Renilla-Glo Luciferase Assay System	Promega	E2710	Reagent containing Renilla luciferase substrate
Britelite plus Reporter Gene Assay System	Perkin-Elmer	6016761	Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity