RNAウイルスの広域スペクトルの化学抑制剤のためのハイスループットスクリーニング
Summary
ウイルス複製を測定するためのインビトロアッセイにおいて大きくルシフェラーゼまたは生物発光が可能な他の酵素を発現する組換えRNAウイルスの開発により改善されてきた。ここでは、詳細な化学ライブラリーから広域スペクトルの抗ウイルス剤を単離するために麻疹およびチクングニアウイルスのような組換え菌株を組み合わせたハイスループットスクリーニングパイプライン。
Abstract
RNAウイルスは、インフルエンザ、気管支炎、デング熱、C型肝炎やはしかなどの主要なヒト疾患の原因である。彼らはまたので、より多くの自然の生態系を貫く増加世界的な交流や人間集団の新たな脅威を表しています。このような新興状況の良い例は、インド洋での2005から2006のチクングニヤウイルスの流行である。ウイルス複製を制御する細胞経路についての我々の理解における最近の進歩は、宿主細胞の機能を標的とする化合物ではなく、ウイルス自体は、RNAウイルスの大きなパネルを阻害し得ることを示唆している。いくつかの広域スペクトル抗ウイルス化合物は、宿主標的指向アッセイで同定されている。読み出しは依然として最も重要スクリーニング戦略を表すしかしながら、細胞変性効果の低減を用いて細胞培養物におけるウイルス複製の阻害を測定する。このような機能の画面が大幅にレポーターを発現する組換えウイルスの開発によって改善されているCA酵素ルシフェラーゼなどの生物発光のpable。本報告では、我々の詳細を広域スペクトル抗ウイルス性プロファイルを有する化合物を同定するために、組換え麻疹および細胞生存率アッセイとチクングニアウイルスを組み合わせたハイスループットスクリーニングパイプラインを、。
Introduction
RNAウイルスはヒト感染の多種多様のために責任があり、両方の公衆衛生および経済的なコストの面で世界的に個体数に大きな影響を与える。効率的なワクチンは、いくつかのヒトRNAウイルスに対して開発され、広く予防的処置として使用される。しかしながら、RNAウイルス感染症に対する治療薬の重大な欠如が依然として存在する。確かに、効率的なワクチンは、デング熱ウイルス、C型肝炎ウイルスやヒトRSウイルス（はhRSV）などの主要なヒト病原体に対して使用できません。また、RNAウイルスは世界的な取引所や生態系に対する人間の影響の頻度が増加している新興疾患の大部分を担当している。 RNAウイルスを表し、この脅威に対して、我々の治療の武器は非常に限られており、1月3日は比較的非効率的である。現在の治療法は、基本的に、自然免疫を刺激するため、組換えI型インターフェロン（IFN-α/β）に基づいていますまたはリバビリンを投与する。このリボアナログの作用機序は、議論の余地がある、おそらくさまざまなメカニズムに依存していますが、細胞内のGTPプールを枯渇携帯IMPDH（イノシン一リン酸脱水素酵素）の阻害は、4明らかに必要不可欠である。リバビリンは、ペグ化IFN-αと組み合わせて、C型肝炎ウイルスに対する主な治療法である。彼らは効率的に鈍い、IFN-α/βは5因子の毒性の発現を介したシグナル伝達と、多くの場合、リバビリン3をエスケープしかし、IFN-α/βとリバビリンの治療は、ほとんどのRNAウイルスに対する生体内で比較的乏しい有効性のある。それが最近、論争のメリット6で重度のはhRSVの疾患に対して承認されたが、これは、リバビリン治療が重要な毒性の問題を発生させているという事実に追加しました。より最近では、いくつかのウイルス特異的治療が開発oでインフルエンザウイルスに対して特に市販されているFノイラミニダーゼ阻害薬3。しかしながら、大きな多様性RNAウイルスの永続的な出現は、比較的近い将来、それらの各々に対する特異的治療の開発を妨げる。全体として、これは近い将来に強力な抗ウイルス分子を同定し、開発するための効率的な戦略の必要性を強調している。
これは、RNAウイルスの大きなパネルに対して活性広域スペクトル阻害剤は、この問題を解決するだろうと言うことは自明である。このような分子は、まだウイルス学者の夢ではあるが、細胞防御メカニズムと自然免疫系の我々のより良い理解は、いくつかの可能性が7,8存在することを示唆している。いくつかの学術および産業の研究室は現在、ウイルスの複製を鈍らせる細胞防御メカニズムや代謝経路の特定の側面を刺激する分子を求めている。このような化合物は、おそらく重大な副作用が表示されますが、急性ウイルス感染に対する治療はの管理となります長期的にいくつかの潜在的な毒性にもかかわらず、それらを許容すること、比較的短時間のED。様々な戦略は、例えば、広域スペクトル抗ウイルス分子を同定するために開発されてきた。いくつかの研究プログラムは、特定の防御または代謝経路を標的とする分子を発見することを目的としている。これには、は、例えば、ウイルス遺伝子発現9を誘発し、そのようなRNASEL 10、ウィルス分解11を促進するためにオートファジー機械などの抗ウイルス因子を活性化する病原体認識受容体は、ヌクレオシドの合成は、ウイルス感染細胞の死を沈殿させ12,13、またはアポトーシスカスケードをパスウェイ14。他のグループは、ターゲットベースではない13,15-17表現型スクリーンを開発しました。その場合には、抗ウイルス分子は、単に所与の細胞系においてウイルス複製をブロックするそれらの能力によって同定される。一般的な仮定は2-3無関係のRNAウイルスを阻害する化合物は、広い種に適したプロファイルを有するであろうということである抗ウイルス分子をectrum。そのような経験的アプローチを選択したヒット化合物の作用のモードは、第即座に決定され、最終的には、抗ウイルス剤のための新規細胞標的の同定につながる可能性がある。興味深いことに、1999年から2008年の間に米国食品医薬品局（FDA）によって承認された新薬のレトロスペクティブ分析では、一般的に、このような表現型の上映は、ファースト·イン·クラスの低分子薬18を発見するために、ターゲットベースのアプローチよりも良いを実行する傾向があることが示されている。
ハイスループット細胞ベースのアッセイでのウイルス複製は、通常、ウイルス細胞変性効果から決定される。試験化合物の存在下で、または384ウェルプレート – 細胞を96で感染させ、培養する。数日後、細胞層は、例えば、クリスタルバイオレットなどの染料で固定し、染色する。最後に、吸光度をプレートリーダーで測定すると、ウイルス複製を阻害する化合物は、あちこちに細胞層を維持する能力によって同定されるm個のウイルス誘導細胞変性効果。あるいは、ウイルス媒介性細胞変性効果は、MTS還元などの標準的な生存率アッセイを用いて評価される。このようなアッセイは、非常に扱いやすく、コスト効果的であるが、3つの主要な制限を受ける。第一に、彼らはこのように19に近づくの代替を求めて、ウイルス複製がわずか数日で細胞変性であるが、これは必ずしも可能ではないウイルス-細胞の組み合わせを必要とする。第二に、それらは、ウイルス複製の間接的な測定に基づいているため難定量的である。最後に、毒性化合物は、陽性ヒットとしてスコアすることができるので、細胞生存率を測定するカウンタースクリーンで除去されなければならない。これらの障害のいくつかを克服するために、組換えウイルス又はレプリコンは、追加の転写単位から、またはウイルスタンパク質遺伝子（いくつかの例は20〜23である）とインフレームで、例えば、EGFP又はルシフェラーゼのようなレポータータンパク質を発現するために逆遺伝学によって操作されている。これらのウイルスは複製し、レポーターPRoteinsは、ウイルスタンパク質自体と一緒に生産されています。これは、ウイルス複製を測定し、候補分子の阻害活性を評価するための非常に定量的なアッセイを提供する。これは、このレポーターシステムは、高感度、事実上の背景を持つ広いダイナミックレンジを発揮するため、ルシフェラーゼ（または生物発光が可能な他の酵素）を発現する組換えウイルスに特に当てはまります。また、全く励起光源は、このように、化合物24の蛍光の干渉を防止する、存在しない。
ここでは、詳細なハイスループットプロトコルは、RNAウイルスの広域スペクトル阻害剤の化学ライブラリーをスクリーニングする。化合物は、ホタルルシフェラーゼ25（rMV2/Luc、 図1、一次スクリーニング）を発現する組換え麻疹ウイルス（MV）に感染したヒト細胞で最初にテストされています。 MVは、注文をモノネガウイルス目に属する、多くの場合、マイナス鎖RNAウイルスの原型メンバーとして考えられているES。このように、MVゲノムはウイルスタンパク質をコードするmRNA分子を合成するために、ウイルスポリメラーゼにより鋳型として使用する。 rMV2/Luc呼ばれる組換えMV株におけるルシフェラーゼ発現は、PとM遺伝子（ 図2A）との間に挿入された追加の転写単位から発現される。並行して、化合物は、ATPの定量によって、培養物中の代謝活性のある細胞（ 図1、一次スクリーニング）の数を評価する商業ルシフェラーゼベースの試薬 を用いてヒト細胞に対するそれらの毒性について試験する。全体の化学ライブラリーを容易に有毒ではなく、効率的にMV複製を遮断する化合物を選択するために、これら2つのアッセイを用いてスクリーニングすることができる。その後、ヒットはチクングニヤウイルス（CHIKV）の複製（ 図1、二次スクリーニング）を損なうする能力についての用量反応MV複製の阻害、毒性がないだけでなく、について再試験されています。 CHIKVはトガウイルス科のメンバーであり、そのゲノムは、APであるositive一本鎖RNA分子。このように、それははしかとMVとCHIKVの両方がRNAウイルスの大きなパネルを阻害する大きなチャンスが阻害化合物とは全く無関係である。構造タンパク質は、サブゲノムmRNA分子の転写および翻訳によってコードされているのに対し、CHIKV非構造タンパク質を直接、ウイルスゲノムから翻訳されています。 CHIKVのための私たちのin vitroでの複製アッセイは、NSP3とのnsP4シーケンス26（ 図2B）との間にレポーター遺伝子を挿入することによって非構造ポリタンパク質の切断された部分としてウミシイタケルシフェラーゼ酵素を発現CHIKV /漣と呼ばれる組換え株に基づいています。ウミシイタケルシフェラーゼ活性の測定は、CHIKVのライフサイクルの初期段階においてウイルス複製の監視を可能にする。
このハイスループットプロトコルを迅速万molecの市販のライブラリーにおいて、広域スペクトル抗ウイルス剤に適したプロファイルを有する化合物を同定するために使用された化学的多様性について濃縮ULES。化合物は、基本的には250〜600ダルトンの範囲の分子量で、5のリピンスキーのルールを次の、そして5以下のD値を記録した。これらの分子のほとんどは、他の商用ライブラリで利用可能な新しい化学物質ではなかった。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここに記載のスクリーニングパイプラインは、RNAウイルスの広域スペクトル阻害剤として適切なプロファイルを有する化合物を選択することを目的とする。万化合物のライブラリーは、このプロトコルでスクリーニングし、前述のフィルタリング基準が適用された場合には、75パーセントよりも優れたMV複製の阻害、 すなわち 40の化合物（0.4％）が陽性と。加えて、それらの約半分は?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は彼の実りのコメントや提案のために博士イヴ·L·ジャニンに感謝します。私たちは彼女の技術的なサポートのために、CHIK /漣とC CombredetためHHガドに感謝したいと思います。パスツールの病気Infectieuses（POVへのプログラムのSTINGとHM- – この作品は、パスツール研究所、センター国立·デ·ラ·ルシェルシュ科学研究（CNRS）、研究所国立·デ·ラ·サンテエトデ·ラ·ルシェルシュMédicale（INSERM）、研究所カルノーによってサポートされていましたL）を、通信社国立）がPOVにLAルシェルシュ（ANR-RPIB、プログラムSTING 2.0を注ぎ、そして「Conseilの地域D'イルドフランス」（ケミカルライブラリプロジェクト、助成N°06から222のI / RとI HM-Lに対して09から1739 / R）。 CHIKV /漣上の作業は、プロジェクトArbOAS（ANR助成金2010-INTB-1601-02）によってサポートされていました。
Materials
| Freedom EVO platform | TECAN | Robotic platform | |
| 96-Well Polystyrene Cell Culture Microplates, White | Greiner Bio One | 655083 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | Luciferase-based viability assay |
| Bright-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2610 | Reagent containing firefly luciferase substrate |
| Renilla-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2710 | Reagent containing Renilla luciferase substrate |
| Britelite plus Reporter Gene Assay System | Perkin-Elmer | 6016761 | Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity |
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