Summary
Diagnostiska ultraljudsundersökningar har visat sig vara effektiva i att diagnostisera olika luftvägssjukdomar hos människor och djur. Vi visar en omfattande ultraljudsprotokoll som används av Dr Zuo labb för att analysera membran kinetik specifikt i musmodeller. Detta är också en icke-invasiv forskning teknik som kan ge kvantitativ information om musen andningsmuskelfunktion.
Abstract
Funktionsanalys av gnagare andningsskelettmuskler, framför membranet, som vanligen utförs genom att isolera muskelremsor med hjälp av kirurgiska ingrepp. Även om detta är en effektiv metod för att bedöma in vitro membran aktivitet, innebär det inte att överleva operationen. Tillämpningen av icke-invasiv ultraljudsavbildning som en in vivo-förfarande är fördelaktigt eftersom det inte bara minskar antalet djur avlivades, men är också lämplig för att övervaka sjukdomsförloppet i levande möss. Således kan vi ultraljud metod sannolikt bidra till utvecklingen av nya behandlingsmetoder som minskar muskelskada inducerad av olika sjukdomar i andningsorganen. I synnerhet, i kliniska diagnoser av obstruktiva lungsjukdomar, har ultraljudsavbildning potential att användas i samband med andra standardtester för att detektera tidig debut av membranet muskeltrötthet. I det nuvarande protokollet, beskriver vi hur man korrekt bedöma membran contractihet i en musmodell med hjälp av ett diagnostiskt ultraljud teknik.
Introduction
Nyligen har diagnostiska ultraljudsavbildningstekniker tillämpats på musmodeller av renovaskulär hypertoni och pankreascancer 1,2. Emellertid är dessa tekniker har inte använts i stor utsträckning i gnagare andningsanalysmuskelfunktion. Därför har vi utvecklat ett diagnostiskt ultraljud metod som ett värdefullt verktyg för längsgående bedömningar av mobilitet membran hos möss in vivo.
Det finns flera fördelar med att diagnostiskt ultraljud. Till exempel är den icke-invasiv, säker, bärbar, och möjliggör realtidsmätningar vid en relativt låg kostnad 3. Särskilt vissa lågfrekventa ultraljudsapparater kunde upptäcka air trapping, ett kliniskt kännetecken för kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL) med mild till svår obstruktivitet 4. Sålunda kan diagnostiska ultraljudsundersökningar fungera som en lättillgänglig och reproducerbar screeningmetod för övervakning i realtid av andningsstörningar.
Diagnostiska ultraljudsavbildningstekniker ofta tillämpas på större djur eller människor. Däremot har det funnits ett begränsat antal ultraljud imaging studier på musmodeller, vilket sannolikt beror på de utmaningar som utför ultraljud på småskaliga ämnen. Det nuvarande protokollet beskrivs ett nytt förfarande för att mäta funktionen membranet i mus. Dessutom, även om det har gjorts flera studier på gnagare på funktionsmembran, de flesta av de resultat som genererades genom att isolera muskelremsor direkt från avlivas djuret 5-7. Däremot skulle med hjälp av en in vivo diagnostiska ultraljudsundersökningar metod för att analysera membran aktivitet minska antalet djur som offras för experiment. Vidare kan långtidsbehandling med fokus på förbättrad membran kontraktilitet noggrant utvärderas via ultraljud i gnagarmodeller utan att offra djur.
ntent "> I vårt laboratorium har vi utvecklat en effektiv metod för att visualisera och analysera mus membran aktivitet med hjälp av en ultraljudsmaskin, som hjälper förståelsen av funktionsmembran in vivo, undviker invasiva metoder till djur, och stöd i utvecklingen av terapeutiska behandlingar för andnings dysfunktion.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som involverar djurförsök godkändes och avslutades i enlighet och överensstämmelse med The Ohio State University Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) regler och riktlinjer.
1. Mus Anesthesia
- Inrätta en ren förfarande bord med en isotermisk dyna insvept i en kirurgisk handduk. Värmedynan skall hållas mellan 30 ° C och 34 ° C för att stabilisera djurets kärntemperatur samtidigt minska risken för stress för djuret.
- Placera musen i en anestesiinduktionskammare med följande parametrar: syreflödeshastighet inställd på 1,5 l / min och isofluran förångare satt till 3,5%. Komplett sedering bör ske inom 1-2 minuter. Om en induktionskammaren inte är tillgänglig, kan en glasklocka användas med ett trådnät placerat vid botten för att undvika direkt djurkontakt med isofluran.
- Omedelbart ta bort musen från induktionskammare när denär helt sövd (uppnås när musen förlorar motorik frivilligt). Applicera en noskonen till djuret för underhåll av anestesi. Flödeshastigheten bör syre reduceras till ungefär 0,5 L / min och isofluran förångare skall ställas in inom området 1,5 till 2,5%.
- Applicera en liten mängd av oftalmologiska salva direkt till hornhinnor för att minska torra ögon 8. Dessutom, under narkos, ska musen upprätthålla en frånvaro av pedaltillbakadragande reflex, bör slemhinnorna förbli en rosa färg, och andning ska visas stadig.
2. Förberedelser för Diagnostic Ultrasound Imaging Förfarande
- Hindra varje ben med musen på den uppvärmda förfarandet bordet med en flyttbar självhäftande, till exempel kirurgtejp.
- Med användning av en elektrisk rakapparat, ta bort hår på den ventrala kroppsytan mellan buken och halvvägs upp brösthålan. Applicera hårborttagningskräm för att ytterligare reFlytta den återstående hår som inte klipps av rakhyveln. Torka av krämen med en fuktig kompress efter 2-3 min.
- Ta bort överflödigt hår med hjälp av en vatten-fuktad kompress och rengör rakade området med 70% alkohol eller motsvarande antiseptisk. Ultraljudssonden kommer att tillämpas på detta område för att visualisera funktionsmembran. En topisk smärtstillande medel kan ges till djur som upplever mindre hudirritation på grund av att hårborttagning.
3. Diagnostic Ultrasound Imaging Protocol
- Slå på ultraljudsanordningen och justera uteffekten (vid behov) på apparaten genom procentsats för att erhålla optimal upplösning.
- Ställ in ultraljudsmaskinen på fråga B (ljusstyrka)-läget M (rörelse)-läge, eller både före avbildning, vilket gör det möjligt för korrekt visualisering av membran musen kontraktion.
- Applicera en liten mängd av ultraljud gel på musens övre buken och massera gelén mot brösthålan.
- Placera ultraljud givare på detta område och vinkla den uppåt mot hjärtat. Justera proben tills en optimerad upplösning av bilden uppnås. OBS: för detta protokoll, är en mikro-konvex array eller linjär infasade givare en idealisk sond att använda tack vare den liten plats och utmärkt axiell upplösning 9; frekvensen behöver justeras över hela bandbredden och för dessa experiment ett intervall av från 6,5 till 12 MHz kan användas.
- Tryck på FREEZE-knappen för att tillfälligt spara membranbilder och visa de valda sammandragningar.
- Spara inspelningen som en cine slinga, som gör det möjligt för senare mätningar av diafragma utflykt samt andningsfrekvensen. OBS: ramar bilder kan sparas i datorns minne eller på en extern hårddisk för framtida analys 9.
- Exakt mäta djupet av membranets rörelse från avslappning till kontraktion med hjälp av de elektroniska skjutmått som är en del av ultraljuds programvaran.
- Konverteracine slinga fil till en MPEG-fil och bestämma andningsfrekvensen genom att räkna antalet av diafragmans sammandragningar under registreringsperioden. Alternativt kan antalet kontraktioner per min (respirationshastigheten) att räknas från den M-mode bild.
4. Inlägg Anestesi Animal Recovery
- Musen ska helt återhämta sig från anestesi inom 1 timme. Lämna inte djuret utan uppsikt tills den har återfått tillräcklig medvetenhet för att upprätthålla sternala VILA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En typisk ultraljudsbild av en membran mus visas i figur 1A. Membran musen maximal vertikal förskjutning registrerades. Detta avstånd beräknades genom att exakt mäta djupet av membranets rörelse från avslappning till kontraktion med hjälp av de elektroniska skjutmått som är en del av ultraljuds programvaran. Tabell 1 visar dessa avståndsmätningar av diafragma sammandragningar från tre olika möss. Efter omvandling av cine slingan fil till en MPEG-fil, var andningsfrekvensen bestäms genom att räkna antalet diafragmans sammandragningar under en sex sekunders registreringsperioden. Denna analys kan utföras med B-mode. Alternativt tillhandahåller M-mode en visualiserad bild av membranet vertikal rörelse samt andningsfrekvensen såsom visas i figur 1B. Dessa resultat visar att denna metod är effektiv i att noggrant observera mus Membran sammandragningar. Dessutom, genom att RECORDI ng funktionsmembran, detta protokoll gör det också möjligt att bedöma två viktiga parametrar, inklusive membran utflykt och andningsfrekvens. Denna avbildningsmetod är användbar för direkt jämförelse mellan frisk och sjuk diafragman. Men Figur 2 visar de potentiella imaging artefakter som kan uppstå när du utför diagnostiska ultraljudsundersökningar.
Figur 1. A. En representant ultraljudsbild av en mus diafragman (B-läge). De heldragna och streckade linjer visar membranet under kontrakterade och avslappnad stater, respektive. B. En representant ultraljudsbild av en upphandlande mus membran (M-läge).pg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. En ultraljudsbild av mus diafragman med förekomsten av eventuella efterklang (A) och komet-svans (B) artefakter (anges med pilarna). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| 1 st mått (mm) | 2: a mätning(Mm) | 3 rd mätning (mm) | Genomsnittlig (mm) ± SD | |
| Mus 1 | 0,96 | 0,92 | 1,06 | 0,980 ± 0,072 |
| Mouse 2 | 0,93 | 0,99 | 1,01 | 0,977 ± 0,042 |
| Mus 3 | 0,91 | 0,93 | 0,89 | 0,910 ± 0,020 |
Tabell 1. Avstånd mätningar av musen membranrörelse. Averages beräknades från tre separata registrerade värden för varje enskild mus. Standardavvikelsen definieras som SD. Observera, djur varians har någon signifikant effekt på mätning av sammandragningar membran (P = 0,1224).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nuvarande försöksprotokoll utvecklar diagnostiska ultraljudsavbildningstekniker är specifika för membran aktivitet i en musmodell via en icke-invasiv, in vivo-metod. Apparatinställningar anestesi är approximeras värden, som kan justeras något för varje djur, eftersom individuella möss kan svara olika på anestesi. För att förhindra felaktig anestesi administration, är det viktigt att regelbundet övervaka mus vitala inklusive hjärtfrekvens, andningsfrekvens och kroppstemperatur. Dessutom måste håret tas bort före ultraljudsundersökning eftersom orakad hår kan sudda ut bilden och förhindra korrekt visualisering av membran sammandragningar.
Vi använde B-mode ultraljudsundersökningar för att tillhandahålla en två-dimensionell (2D) tvärsektionsbild av membranet mus och används M-läge för att övervaka membranrörelse kinetik. Det är viktigt att använda en mikro-konvex array givare för 2D-bilder, eftersom den proVides förbättrade axiella upplösning av ytligt belägna anatomiska strukturer jämfört med traditionella linjär array givare 10. Det är också viktigt att notera att elektronisk fokusering av bilden försämras när fokallängden utsträcks 9. Dessutom bör en tillräcklig mängd av ultraljud gel appliceras på musens buk för att förvärva distinkta bilder. Gelén begränsar möjligheten att luftfickor mellan huden och givaren för att producera en högupplöst bild 11.
Även om tillämpningen av diagnostiska ultraljudsundersökningar är lovande, det finns begränsningar för att använda denna teknik som ett forskningsverktyg. Till exempel är det viktigt att slutanvändaren är välutbildade att få exakta och reproducerbara bilder och kan tolka membran aktivitet konsekvent. Vidare spegel bildartefakter uppstå när en anatomisk struktur, såsom diafragman, visas två gånger på bildskärmen. Detta är övervägaed en utbrednings artefakt och resultat i reflektion är felaktigt placerad i ultraljuds operativsystemet 12,13. Till exempel kan ultraljudstransduktorer producera flera off-axel balkar som kan reflektera bort en anatomisk struktur som inte är i vägen för helljuset 12,14. Dessutom, på grund av refraktion, strålen kanske inte alltid färdas i en rak linje från reflektorn. Eftersom ultraljud endast kan behandla signalen som återförs till givaren och inte kan bestämma tidpunkten för brytning, kan bildskärmens sannolikt visa samma anatomiska strukturen två gånger på olika avstånd och därmed uppvisa en spegelbild artefakt.
En ytterligare förökning artefakt som påträffas är efterklang. Denna artefakt visar jämnt fördelade parallella linjer som vanligen är placerade vinkelrätt mot ultraljudstrålen (Figur 2A) 15. Denna typ av artefakt kan störa en sann områdetvision och mask specifika anatomiska strukturer av intresse. Därför bör försiktighet iakttas vid analys av data. En undergrupp av efterklang artefakt är kometen-svans eller B-linjer. Dessa är en typ av efterklang artefakt som bildar en vertikal bana täta ekon, som sträcker sig från membranet till kanten av ultraljuds skärmen 16 (såsom visas i Figur 2B). Dessa artefakter är producerade av multipla reflektioner som sker mellan eller inom en struktur och omvandlaren 13, som kan minimeras genom att vinkla givaren för att undvika en vinkelrät kontakt med det speglande objekt 17. Trots dessa begränsningar gör diagnostiska ultraljudsundersökningar en säker, känslig och snabb analys av funktionsmembran i en musmodell, vilket potentiellt kan utvärdera gnagare membranfunktion och bidra till att utveckla nya prekliniska terapier för andningsbesvär.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag från OU allmänna fonden G110 och forskning Excellence Fund för biomedicinsk forskning och OSU-HRS Fund 013.000. Författarna vill tacka Lauren Chen för hennes hjälp med att förbereda detta manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Veterinary digital ultrasonic diagnostic imaging system | Edan | DUS 3 VET | Ultrasound parameters include: frequency of 6.5 MHz, Depth of 29 mm. Note: An equivalent ultrasound machine may be used for this protocol |
| Micro-convex array transducer | Edan | C611 | Or equivalent |
| GE Logiq i hand-carried unit (HCU) | GE Healthcare | GE Logiq i hand-carried unit (HCU) | Or equivalent |
| GE 12 MHz linear array probe | GE Healthcare | 12L-RS | Or equivalent |
| Veterinary anesthetic vaporizer | Webster Veterinary | Serial #: W422021 | Isoflurane was exclusively used with this vaporizer (or equivalent). A custom made induction chamber for anesthesia was assembled for initial anesthesia. Maintenance anesthesia was performed using a nose cone |
| Isothesia (Isoflurane, USP) | Butler Schein | 29405 250ML PVL | Or equivalent |
| Enviro-pure anesthesia absorbing canister | Surgivet Smiths Medical PM, Inc. | Part #: 32373B10 | Or equivalent |
| Ultrasound transmission gel | HM Sonic | N/A | Or equivalent |
| Puralube vet ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | Or equivalent |
| Deltaphase isothermal pad | Braintree Scientific Inc. | 39DP | Or equivalent |
| Hair remover | Nair | N/A | Or equivalent |
| Electric razor | Remington | HC-5015 | Or equivalent |
| Surgical tape | 3M Micropore | 1530-1 | Or equivalent |
| Gauze sponges | Dynarex | 3262 | Or equivalent |
References
- Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106 (2009).
- Franchi, F., et al. Non-invasive assessment of cardiac function in a mouse model of renovascular hypertension. Hypertension Research: Official Journal of the Japanese Society of Hypertension. , (2013).
- Coatney, R. W. Ultrasound imaging: principles and applications in rodent research. ILAR Journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 42, 233-247 (2001).
- Morenz, K., et al. Detection of air trapping in chronic obstructive pulmonary disease by low frequency ultrasound. BMC Pulmonary Medicine. 12, 8 (2012).
- Gilliam, L. A., Moylan, J. S., Ann Callahan, L., Sumandea, M. P., Reid, M. B. Doxorubicin causes diaphragm weakness in murine models of cancer chemotherapy. Muscle & Nerve. 43, 94-102 (2011).
- Ferreira, L. F., Campbell, K. S., Reid, M. B. Effectiveness of sulfur-containing antioxidants in delaying skeletal muscle fatigue. Medicine and Science in Sports and Exercise. 43, 1025-1031 (2011).
- Zuo, L., Clanton, T. L. Reactive oxygen species formation in the transition to hypoxia in skeletal muscle. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 289, 207-216 (2005).
- Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. J. Vis. Exp. , (2010).
- Hedrick, W. R., Hykes, D. L., Starchman, D. E. Ultrasound Physics and Instrumentation. , 4th edn, Elsevier Mosby. 445 (2005).
- von Sarnowski, B., Khaw, A. V., Kessler, C., Schminke, U. Evaluation of a microconvex array transducer for the ultrasonographic examination of the intrathoracic segments of the supraaortic arteries. Journal of Neuroimaging: Official Journal of the American Society of Neuroimaging. 20, 246-250 (2010).
- Stocksley, M. Abdominal Ultrasound. , Cambridge University Press. 7-8 (2001).
- Kremkau, F. W., Taylor, K. J.
- Kremkau, F. W. Diagnostic Ultrasound: Principles and Instruments. Saunders Elsevier. , 7th edn, 521 (2006).
- Laing, F. C., Kurtz, A. B. The importance of ultrasonic side-lobe artifacts. Radiology. 145, 763-768 (1982).
- Abu-Zidan, F. M., Hefny, A. F., Corr, P.
- Gargani, L. Lung ultrasound: a new tool for the cardiologist. Cardiovascular Ultrasound. 9, 6 (2011).
- Sanders, R. C., Winter, T. Clinical Sonography A Practical Guide. , 4th edn, Lippincott Williams & Wilkins. 632 (2007).
