Die Verkapselung von Zellfreie Transkription und Übersetzung Machinery in Vesikel über die Errichtung von Cellular Mimics

Summary

Hier beschreiben wir einfache Methoden für die Herstellung von Vesikeln, die Verkapselung der Transkription und Translation Maschinen, und die Überwachung der Herstellung von Proteinen. Die resultierende zellfreie Systeme können als Ausgangspunkt, von dem zunehmend komplexen zellulären Mimik genutzt werden müssen.

Abstract

Da das Interesse Verschiebungen von einzelnen Molekülen in den Systemen der Moleküle haben eine zunehmende Zahl von Laboratorien versucht, von unten nach oben, die zelluläre Mimik besser zu vertreten, die Komplexität der zellulären Leben aufzubauen. Bis heute gibt es eine Reihe von Wegen, die ergriffen werden, um zelluläre compartmentalized Mimik bauen könnte, einschließlich der Nutzung von Wasser-in-Öl-Emulsionen, mikrofluidischen Bauteilen und Bläschen. Jede der Optionen hat spezifische Vor-und Nachteile. Zum Beispiel, geben Wasser-in-Öl-Emulsionen hohe Verkapselungseffizienz aber nicht gut imitieren die Permeabilitätsbarriere lebenden Zellen. Der primäre Vorteil der hier beschriebenen Verfahren ist, dass sie sich einfach und billig zu implementieren ist. Transkriptions-Translations-Maschinerie im Inneren des Phospholipid-Vesikel durch einen Prozess, gemeinsame Instrumente, wie z. B. einer Zentrifuge Verdampfer und einem Extruder nutzt verkapselt. Die Reaktionen werden durch Fluoreszenz-Spektroskopie verfolgt. Das Protokolls kann für die rekombinante Proteinexpression, den Bau von zellulären Mimik, die Erforschung der Mindestanforderungen für die zellulären Lebens, oder der Montage von genetischen Schaltung angepasst werden.

Introduction

Zellfreie, in vitro Transkriptions-Translations-Reaktionen und die Erzeugung von Vesikeln aus synthetischen Lipiden sind nichts Neues. Doch die Kombination der beiden in eine zelluläre imitieren ist deutlich mehr challenging1-6. E. coli Zellextrakte mit oder ohne T7-RNA-Polymerase kann als Quelle der Transkriptions-Translations-Maschinerie ^7,8 verwendet werden. Zellextrakte Nutzen aus dem Vorhandensein von zusätzlichen zellulären Komponenten, die Proteinexpression und Falten erleichtern. Alternativ kann auch eine Mischung aus einzeln gereinigt RNA-und Protein-Moleküle, dh die PURE System ^9, können verwendet werden, um zu vermitteln intravesikulären Proteinsynthese ^4,10-14 werden. Die PUR-System ermöglicht den Bau von vollständig definierten zellulären Mimik und nicht von der Nuklease-Aktivität in Zellextrakten vorhanden leiden. Praktisch bedeutet dies, dass viel weniger DNA-Template benötigt wird, wodurch Prozesse mit niedrigem Verkapselungswirksamkeit ¹¹ </sup>. Obwohl weniger häufig verwendet werden, können zelluläre Mimetika mit Zellextrakten aus eukaryotischen cells15 abgeleitet gebaut werden. Bisher wurden genetisch kodierte gekapselten Kaskaden und zellulären Mimetika, die die Umwelt spüren worden ^16-18 gemeldet.

Der einfachste Weg, Transkriptions-Translations-Reaktionen zu überwachen ist, die Fluoreszenz-oder Lumineszenz von genetisch codierten Elemente zu messen. Typischerweise werden Glühwürmchenluciferase ¹⁹ oder GFP verwendet, obwohl in vitro Reaktionen häufig durch radioaktive Markierung gemessen werden. Fluoreszenzdetektion ermöglicht zusätzlich zur Überwachung der Populationen von Vesikeln ^20,21 durch Durchflusszytometrie basierende Verfahren und bietet damit einen Einblick in die stochastische Natur der biologischen Fortsätze. Diese Monitoring-Methoden wurden genutzt, um eine kleine Gruppe von Design-Regeln und eine Bibliothek von Teilen, von denen aus zu bauen, darunter eine Sammlung von fluoreszierenden Proteinen, die kompatibel mit i definierenn vitro ^{Transkriptions-Translations-22,} den Einfluss der genetischen Organisation Ausdruck ^22, die Aktivität Sigmafaktoren ¹⁶ und die Effizienz der Transkriptionsterminatoren ^23. Dennoch bleibt viel zu tun, die die Fähigkeit des Gebäudes in vitro vorhersehbar, genetisch codierte Geräte erhöhen werden muss.

Es gibt viele Methoden, um Vesikel zu machen. Die gängigsten Methoden sind abhängig von der Erzeugung einer dünnen Lipidfilm auf einer Glasoberfläche durch Resuspension in wässrigen Solution24 gefolgt. Wenn die wässrige Lösung Transkriptions-Translations-Maschinen, zum Beispiel, dann ein Teil der Vesikel enthalten würde, die notwendigen Komponenten zur Herstellung von Proteinen. Allerdings ist die Verkapselungseffizienz solcher Verfahren gering, so dass nur ein kleiner Prozentsatz von Vesikeln aktiv sind. Viele der alternativen Methoden durch viel höhere Kapselung eff gekennzeichnetizienz nutzen die Umwandlung der Wasser-in-Öl-Emulsion Tröpfchen Vesikel. Während es wahrscheinlich ist, dass solche Methoden werden in Zukunft alltäglich, leiden derzeit diese Methoden von der Notwendigkeit von Spezialgeräten und geben Vesikel mit veränderten Zusammensetzungen Membran ^25. Ein deutlicher Vorteil der Wasser-in-Öl-Vesikel-Verfahren ist das Potential Membran Lamellaritätsindex steuern. Das hier beschriebene Verfahren ist auf der dünnen Fettfilm Protokoll vom Yomo Labor ¹¹ mit leichten Modifikationen einschließlich einer zusätzlichen Homogenisierung Schritt beschrieben wird. Diese Methode ist einfach, billig und robust Vesikel gibt auch für die Verkapselung von Transkriptions-Translations-Maschinen geeignet.

Protocol

1. Vorbereitung der DNA-Vorlage Entschlacken Plasmid aus einem Standard-Labor-Stamm von E. coli, wie E. coli DH5a oder Nova Blau mit einem kommerziellen Kit. Alternativ kann eine lineare PCR-Produkt in ähnlicher Weise mit einem kommerziellen Kit gereinigt werden. Eluieren der DNA mit H 2 O nur. Phenol-Chloroform extrahieren die DNA-Lösung 26. Bestimmen der DNA-Konzentration und Reinheit durch UV-Absorption oder andere geeignete Verfahren, zB. Es ist wichtig, hochreinen DNA für eine effiziente Transkription-Translation verwendet werden. 2. Vorbereiten der Thin Film Lipid Das trockene Lipidpulver und lösen sich in Lösungsmittel. Für 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC) werden Stammlösungen in Chloroform bei einer Konzentration von 40 mg / ml hergestellt. Hinweis: Organische Lösemittel muss immer mit Glaspipetten und Flaschen verarbeitet werden. Mit anderen Worten, sind die Kunststoffteile nicht verwendet werden. Shop stock Lösungen in luftdichten, Lösungsmittel beständig Braunglasflaschen bei -20 ° C, vorzugsweise unter Argon. Aliquot 12 mmol POPC (220 ul von 40 mg / ml Stammlösung) in eine 5 ml-Rundkolben. Verdampft das Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer (Abbildung 1), um die dünne Lipid-Film zu erzeugen. Befestigen Sie den Rundkolben der Destillation Rohr mit einem kreisförmigen Clip und starten Sie die Rotation des Kolbens. Initiieren Sie die Zirkulation des Wassers durch den Verflüssiger. Mit einem Wärmebad ist nicht notwendig, da Chloroform hat einen niedrigen Siedepunkt von 61,2 ° C bei Normaldruck. Stellen Sie sicher, dass das System zur Atmosphäre hin offen, indem dass der Hahn geöffnet ist. Schalten Sie die Vakuumpumpe und schließen Sie langsam den Hahn, um das Vakuum auf das System anzuwenden. Ein dünner Lipidfilm an der Wand des Rundkolben während Rotationsverdampfung Bilden eines opaken Films abgelagertdas ist mit bloßem Auge sichtbar. Lassen Sie die Rotationsverdampfen für 0,5-2 Stunden fortsetzen. Um den Prozess zu stoppen, langsam loslassen den Unterdruck, stoppen Sie die Rotation, und entfernen Sie den Rundkolben. 3. Lipid Resuspension und Vesicle Homogenisierung 1 ml 18,2 MOhm H 2 O auf die dünne Lipid-Film direkt in den Rundkolben. Kräftig Wirbel die Lösung bei maximaler Geschwindigkeit etwa 3.200 Umdrehungen pro Minute, bis die Lipid-Film löst sich von Glas, die mit bloßem Auge beobachtbar ist. Übertragen Sie die Lipid-Dispersion in ein 2 ml Reaktionsgefäß. Set-up ein Ring stehen, um einen Homogenisator mit einer 5 mm Spitze zu halten. Legen Sie eine Mikrozentrifuge Stand unterhalb der Homogenisator einen sicheren Halt des Lipiddispersion. Spülen Sie die Dispergierelement der Homogenisator durch Eintauchen der Spitze in 18,2 MOhm H 2 O und läuft für ein paar Sekunden. Legen Sie die Dispergierelement direkt in den Lipiddispersion Gewährleistung than der Spitze nicht berühren den Boden des Mikrozentrifugenröhrchens. Homogenisieren für 1 min auf Stufe 4 oder 14.000 Umdrehungen pro Minute. 4. Vesicle Extrusion und Gefriertrocknung Montieren Sie die Teile des Mini-Extruder (Abbildung 2), die aus einem äußeren Gehäuse besteht und eine Überwurfmutter, die zwei Teflon-Membran unterstützt, zwei O-Ringen und einem Teflon Lager beherbergt. Zeigen die beiden O-Ringe in die Nuten der inneren Membran unterstützt. Prewet zwei Filtern und einem 400 nm Membran. Die Filter werden auf die Teflon innerhalb der O-Ringe werden mit der Membran zwischen ihnen platziert. Zeigen die Membran unterstützt in den Extruder äußeren Gehäuse und der Membran durch zwei Filter zwischen den O-Ringen umgeben. Legen Sie die Teflon Lager im Inneren des Gehäuses und befestigen Sie die Überwurfmutter und von Hand anziehen. Spülen Sie zwei Spritzen und füllen mit einem 18,2 MOhm Wasser. Legen Sie die Spritze Nadeln in das kleine holes im Teflon an jedem Ende des Extruders Montage. Die Nadeln sollten in leicht schieben, nicht mit Gewalt die Nadeln. Sichern Sie den Extruder mit den Spritzen in den Extruder Gehäuse und befestigen. Führen Sie das Wasser durch den Extruder, indem Sie langsam das Wasser aus einer Spritze und in die andere. Dies stellt einen Durchgang. Wiederholen Sie dies für insgesamt drei Durchgänge gewährleisten, dass es keine Lecks vorhanden sind. Entfernen Sie die Spritze mit Wasser und entsorgen des Wassers. Füllen einer Spritze mit der Probe, dem Extruder befestigt und langsam an den Vesikel-Lösung durch die Membran, wie oben beschrieben in Schritt 4.3. Wiederholen 10x für insgesamt 11 Kanäle. Da die Extrusion Prozess wird die Probe weniger trübe und leichter durch die Membran zu drücken. Eine plötzliche Abnahme des Widerstandes jedoch gewöhnlich einen Zerreißen der Membran. Übertragen Sie die extrudierte Vesikel-Lösung und machen 40 ul Aliquots der Vesikel in Mikrozentrifugenröhrchen.Blitz einfrieren Jedes Aliquot entweder Trockeneis oder in flüssigem Stickstoff. Lyophilisieren jedes Aliquot mit einem Zentrifugalverdampfer Nacht bei 30 ° C. Bewahren Sie die lyophilisierten leeren Vesikel bei -20 ° C. 5. Kapselung Transkriptions-Translations-Maschinerie Mischen der Komponenten des Transkriptions-Translations-Reaktion fügt 20 Einheiten RNase-Inhibitor. Inkubation auf Eis. In der DNA-Vorlage. Für eine Kontrollreaktion, 250 ng von einem Plasmid oder einem ähnlichen mVenus fluoreszierendes Protein hinter einem T7-Transkriptions-Promotor und ein starker E. coli Ribosomenbindungsstelle empfohlen. Bringen Sie das Endvolumen auf 25 ul mit RNase-freiem Wasser. Hydrate ein Aliquot lyophilisierter Vesikeln (aus Stufe 4.6) mit 10 ul der Umsetzung in Schritt 5.3 montiert. Vortexen der Mischung, bis die Bläschen sind suspendiert. Das sollte weniger als 30 Sekunden. Inkubieren Sie die Reaktion auf Eis für 30 min, um die Vesikel zu schwellen. Verdünnen Sie die Vesikel Mischung 20-fach bis zu einem Endvolumen von 30 ul durch Zugabe von 1,5 ul Vesikel in 27,0 ul 50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7,4 und 1,5 ul von 20,2 mg / ml Proteinase K. DNase und RNase kann auch an dieser Stelle hinzugefügt werden, als Alternative zur Proteinase K extravesikulären Material abbauen zu können. Inkubieren für mindestens 2,5 Stunden bei 37 ° C. 6. Mikroskopie Untersuchen Sie die Vesikel und den Fortschritt des fluoreszierenden Proteins Produktion zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Die Vesikel werden einen größeren Durchmesser als die 400 nm Porengröße der Membran für Vesikel Extrusion. Bereiten Sie einen Probenraum, indem ein 20 x 5 mm Silizium-Spacer auf eine Standard-Objektträger. Je 10 ul Vesikel in den Probenraum. Legen Sie einen silikonisierten Deckglas über die Kammer. Beachten Sie die Vesikel mit einem 63X Öl-Dispersion or ähnliches Ziel von Hellfeld-und Fluoreszenz-Mikroskopie mit dem entsprechenden Filter-Set für die Ausgebeuteten fluoreszierenden Proteins.

Representative Results

Fluoreszenzmikroskopie zeigt, dass die Fluoreszenz nur im Inneren der Vesikel beobachtet, weil extravesikulären Material enzymatisch abgebaut (Abbildung 3). Für die Expression von mVenus beginnt intravesikulären Fluoreszenz nach 1,5 Stunden bei 37 ° C beobachtet werden und erreicht maximale Fluoreszenzintensität innerhalb von 6 Stunden. Die optimale Temperatur und Inkubationszeit kann in Abhängigkeit von den spezifischen verwendeten Konstrukte. Beispielsweise reifen verschiedenen fluoreszierenden Proteinen sehr unterschiedlich in einer temperaturabhängigen Weise. Mit anderen Worten, ist die Beobachtung der Proteinproduktion nicht allein abhängig Proteinsynthese und Falten, sondern auch von Chromophor-Bildung. Insgesamt kann die Proteinsynthese durch Einbau Membranprotein Poren auf einen Zustrom von abgereichertem Komponenten, die für die Transkription und Translation 27 erlauben erhöht werden. Es wird empfohlen, zur Durchführung einer analogen Transkriptions-Übersetzungention Reaktion in Abwesenheit von Vesikeln, um sicherzustellen, dass die ausgenutzt Genkonstrukt funktionsfähig ist. Diese Steuerung Reaktion wird leichter durch Fluoreszenz-Spektroskopie, anstatt Mikroskopie überwacht. Abbildung 4 zeigt eine in vitro Transkriptions-Translations-Reaktion eines Konstrukts Codierung mVenus. Unverkapseltem Reaktionen geben insgesamt viel höher als vergleichbare Fluoreszenzintensitäten intravesikulären Reaktionen. Dies ist aufgrund der Verkapselung Effizienz und aufgrund der insgesamt intravesikulären Volumen viel kleiner als die extravesikulären Volumen (dh ein Verdünnungseffekt). Abbildung 1. Der Rotationsverdampfer und Vakuumpumpe. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht . <p class="jove_content"fo: keep-together.within-page = "always"> Abbildung 2. Das Gehäuse und Teile des Extruders werden gesondert ausgewiesen. Von links nach rechts, unterstützt Spritze, Überwurfmutter, Teflonlager, innere Membran mit schwarzen O-Ringe einander zugewandten Extruder Außengehäuse und zweite Spritze. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht . . Abbildung 3 Fluorescence Bilder mVenus Protein-Produktion in Liposomen A und C:.. Hellfeld Bilder multilamellarer Vesikel nach 1,5 h und 2,5 h und B &# 160; D: Die Herstellung von mVenus durch Fluoreszenz (grün) nach 1,5 und 2,5 Stunden, jeweils visualisiert. Maßstab ist 20 um. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht . 4. In vitro Kontrollreaktion von verkapselten in vitro Transkription und Translation mVenus. Fluoreszenzintensität wurde alle 5 min über 4 Stunden gemessen. Die Daten wurden mit einem Real-Time-PCR-Gerät erworben. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Discussion

Obwohl zellfreien synthetischen Biologie ist immer noch in den Kinderschuhen steckt, haben Fortschritte ein Fundament, von dem zunehmend komplexen Zell-ähnlichen Systemen gemacht werden verlegt. Die Wiederherstellung der Transkriptions-Translations-Maschinen aus vollständig definierten Komponenten ⁹ innerhalb von Vesikeln ²⁸ war von besonderer Bedeutung bei der Erleichterung später Anstrengungen beim Bau umweltfreundlicher reagiert künstliche cells17, 18. Ebenso künstlichen Zelle Studien verwendet worden, um Sonde Evolutionsprozessen ^4,29,30, den Mechanismus zu RNA-und Proteinsynthese ^22,31, die Einflüsse von metabolischen load32, 33 und die Anordnung von viralen Partikeln ^34. Wichtig ist, dass genug Wissen existiert nun, dass grundlegende zelluläre Funktion innerhalb von Vesikeln können im Labor nach diesen früheren Berichten und den Protokollen beschrieben rekonstituiert werden.

Abgesehen davon, dass einfach die beschriebene Kapselung procedure hat mehrere Vorteile. Zum Beispiel können viele leere, gefriergetrockneten Aliquots Vesikel im Voraus gebucht werden und bei -20 ° C für die spätere Verwendung. Das Protokoll nicht Gegenstand biologischer Moleküle, organische Lösungsmittel, starken Temperaturschwankungen oder lange Zeiträume der Dialyse. Wir erwarten, dass die Sanftheit des Verfahrens wird den Einbau von zusätzlichen Komponenten zu erleichtern, wie gebraucht. Wir haben auch keine negativen Auswirkungen auf die Änderung der Lipidzusammensetzung der Membran auf Einkapselung oder Transkriptions-Translations-Effizienz beobachtet. Daher könnte Lipide zugänglicher den Einbau von Membranproteinen, spezifische Morphologie oder Visualisierung denkbar ausgenutzt werden.

Der größte Nachteil bei dem beschriebenen Verfahren ist, dass die resultierenden Vesikel nicht homogen in der Größe oder Lamellaritätsindex. Für viele Anwendungen sind diese Schwierigkeiten nicht mit der Interpretation der Daten beeinträchtigen. Jedoch können bei Bedarf weitere Schritte schmalen th aufzunehmene Größenverteilung und verringern die Schichten der Membranen, wie weitere Runden der Extrusion nach der Einkapselung, Gefrier-Auftau-, Dialyse oder ^35. Zweifellos bessere Methoden, die diese und andere Probleme zu umgehen entwickelt werden. Bis dahin finden wir das hier beschriebene Protokoll zu gut für den Bau von zellulären Mimik geeignet sein.

Materials

Quick Spin Mini-prep kit	Qiagen	27104
Spectrometer	NanoDrop 1000	NDB767ND
POPC	Avanti Polar Lipids	770557	MW 760 g/mol Transition Temp -2 °C CAS# 26853-31-6
Ethanol	Sigma Aldrich	459836	Anhydrous, >99.5%
Phenol-choloroform-isoamyl alcohol 25:24:1, for molecular biology use	Sigma Aldrich	P3803-100mL	Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA
Chloroform	Biotech Grade Fluka	496189-1L	Contain ethanol at 0.5-1.0% v/v as stabilizer
Brown amber glass bottles	VWR	89043-518	55X 48 mm
Rotary evaporator	Buchi Rotovapor R-210/Sigma	Z563846EU-1EA	With jack and water bath, 29/32 joint 240 V
Analog vortex mixer	VWR	945300	Speed 1,000-3,200 rpm
Homogenizer	IKA T10 Basic Ultra-Turbax	3420000
Mini-extruder	Avanti Polar Lipids	610020
Extruder filters	Whatman	610014	drain disc 10 mm
Extruder polycarbonate membrane 400 nm	Whatman	61007	nuclepore polycarbonate
Speed vacuum	Labconco	7970011	Centritrap DNA concentrator
PURExpress kit	New England Biolabs	NRM #E6800S
RNAse inhibitor (40,000 U/ml)	New England Biolabs	#M0307S
Proteinase K (20.2 mg/ml)	Fermentas	#EO0491
Microscope	Zeiss Observer Z1with a AxioCam MRm camera
RealTime	CFX96 Real time PCR Detection System (Biorad)
Silicon press to seal  -Molecular Probe	Life Technologies	P18174	Resistant from  -25-30 °C
Siliconized glass circle cover slides	Hampton Research	HR3-231	Diameter= 22 mm
ImageJ	NIH