La encapsulación de la transcripción en células libres y las máquinas de traducción en vesículas para la Construcción de Imitadores celulares

Summary

En este documento se describen los métodos simples para la preparación de vesículas, la encapsulación de la transcripción y la maquinaria de traducción, y el seguimiento de la producción de proteínas. Los sistemas libres de células resultantes se pueden utilizar como un punto de partida para construir imita celulares cada vez más complejas.

Abstract

Como los cambios de interés a partir de moléculas individuales a los sistemas de moléculas, un número cada vez mayor de laboratorios han intentado construir de abajo hacia arriba imita celulares que representan mejor la complejidad de la vida celular. Hasta la fecha, hay una serie de caminos que se pueden tomar para construir imita celulares compartimentados, incluida la explotación de emulsiones de agua en aceite, dispositivos de microfluidos y vesículas. Cada una de las opciones tiene sus ventajas y desventajas específicas. Por ejemplo, emulsiones de agua-en-aceite dan de alta eficiencia de encapsulación, pero no imitan bien la barrera de permeabilidad de las células vivas. La principal ventaja de los métodos descritos en este documento es que todos ellos son fácil y barato de implementar. Maquinaria de transcripción-traducción está encapsulado en el interior de vesículas de fosfolípidos a través de un proceso que explota la instrumentación común, tal como un evaporador centrífugo y un extrusor. Las reacciones se controlan por espectroscopia de fluorescencia. El protocolos puede ser adaptado para la expresión de proteínas recombinantes, la construcción de imitadores celulares, la exploración de los requisitos mínimos para la vida celular, o el montaje de circuitos genéticos.

Introduction

Libre de células, in vitro reacciones de transcripción-traducción y la generación de vesículas de lípidos sintéticos no son nada nuevo. Sin embargo, la combinación de los dos en un celular imitar es significativamente más challenging1-6. E. extractos de células de E. coli con o sin ARN polimerasa de T7 se pueden utilizar como una fuente de maquinaria de transcripción-traducción ^7,8. Los extractos celulares se benefician de la presencia de componentes celulares adicionales que pueden facilitar la expresión de la proteína y plegable. Alternativamente, una mezcla de ARN purificados individualmente y moléculas de proteínas, es decir, el sistema PURE ^9, se puede utilizar para mediar en la síntesis de proteínas intravesicular ^4,10-14. El sistema PURE permite para la construcción de imita celulares totalmente definidos y no sufre de la actividad nucleasa que se encuentra en extractos de células. Prácticamente, esto significa que se requiere mucha menos plantilla de ADN, facilitando así los procesos con baja eficiencia de encapsulación ¹¹ </sup>. Aunque se usa con menos frecuencia, imita celulares pueden ser construidos con extractos de células derivadas de eucariotas cells15. Hasta el momento, cascadas encapsulados codificados genéticamente e imita celulares que detectan el entorno se han reportado ^16-18.

La forma más sencilla de controlar las reacciones de transcripción-traducción es para medir la fluorescencia o luminiscencia de elementos codificados genéticamente. Típicamente, la luciferasa de luciérnaga ¹⁹ o GFP se utilizan, aunque en reacciones in vitro se miden con frecuencia por radiomarcaje. Detección de fluorescencia permite, además, para el seguimiento de las poblaciones de vesículas ^20,21 través de métodos basados ​​en citometría, lo que ofrece una idea de la naturaleza estocástica de los procesos biológicos similares. Estos métodos de seguimiento se han utilizado para definir un pequeño conjunto de reglas de diseño y una biblioteca de partes desde la que construir a partir de, incluyendo una colección de proteínas fluorescentes que son compatibles con in in vitro de transcripción-traducción ^22, la influencia de la organización genética en la expresión ^22, la actividad de los factores sigma ^16, y la eficiencia de los terminadores de la transcripción ^23. Sin embargo, aún queda mucho que hay que hacer para aumentar la capacidad de construir predecible in vitro, dispositivos codificados genéticamente allí.

Hay muchos métodos disponibles para hacer vesículas. Los métodos más comunes dependen de la generación de una película delgada de lípido sobre una superficie de vidrio seguido de resuspensión en solution24 acuosa. Si la solución acuosa contiene maquinaria de transcripción-traducción, por ejemplo, a continuación, una fracción de las vesículas formadas habría contener los componentes necesarios para la producción de proteínas. Sin embargo, la eficiencia de encapsulación de tales métodos es baja, lo que significa que sólo un pequeño porcentaje de vesículas están activos. Muchos de los métodos alternativos caracterizados por mucho más ef encapsulacióniciency explotar la conversión de gotitas de la emulsión agua-en-aceite a las vesículas. Si bien es probable que tales métodos serán comunes en el futuro, en la actualidad estos métodos adolecen de la necesidad de equipo especializado y dan vesículas de membrana con composiciones alteradas ^25. Una clara ventaja de agua-en-aceite a los métodos de vesículas es el potencial para controlar lamelaridad membrana. El método descrito en este documento se basa en el protocolo de película delgada de lípido descrito por el laboratorio Yomo ¹¹ con ligeras modificaciones, incluyendo una etapa de homogeneización adicional. Este método es fácil, barato y da vesículas robustos y adecuados para la encapsulación de la maquinaria de transcripción-traducción.

Protocol

1. Preparación de la plantilla de ADN Purificar plásmido a partir de una cepa de laboratorio estándar de E. coli, tales como E. coli DH5a o Nova azul con un kit comercial. Alternativamente, un producto de la PCR lineal se puede purificar de manera similar con un kit comercial. Eluir el ADN con H 2 O solamente. Fenol-cloroformo extracto de la solución de ADN 26. Determinar la concentración de ADN y la pureza, por ejemplo, mediante la absorbancia UV u otros métodos adecuados. Es importante la utilización de ADN altamente puro para una eficiente transcripción-traducción. 2. Preparación de la película delgada de lípidos Pesar el polvo de lípido seca y se disuelve en el disolvente. Para 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), soluciones madre se prepararon en cloroformo a una concentración de 40 mg / ml. Nota: Disolventes orgánicos siempre deben manipularse con pipetas de vidrio y botellas. En otras palabras, nunca debe ser utilizado plástico. S Storesoluciones tac, en botellas de aire ajustados resistente a los disolventes de vidrio ámbar a -20 ° C, preferiblemente en atmósfera de argón. Alícuota de 12 mol POPC (220 l de 40 mg / ml de solución madre) en un matraz de fondo redondo de 5 ml. Se evapora el disolvente con un evaporador rotatorio (Figura 1) para generar la película delgada de lípido. Fije firmemente el matraz de fondo redondo al tubo de destilación con un clip circular y comenzar la rotación del matraz. Iniciar la circulación de agua a través del serpentín del condensador. El uso de un baño de calor no es necesario, porque cloroformo tiene un bajo punto de ebullición de 61,2 ° C a la presión atmosférica normal. Asegúrese de que el sistema está abierto a la atmósfera por la comprobación de que la llave de paso está abierta. Encienda la bomba de vacío y cierre lentamente la llave de paso para aplicar el vacío al sistema. Una película delgada de lípido se deposita sobre las paredes del matraz de fondo redondo durante la evaporación rotatorio formando una película opacaque es visible por el ojo. Deje que la evaporación rotatoria continuará por 0.5-2 horas. Para detener el proceso, suelte lentamente la presión de vacío, detener la rotación, y retire el matraz de fondo redondo. 3. La resuspensión de lípidos y homogeneización Vesícula Añadir 1 ml 18.2 mW H 2 O a la película lipídica delgada directamente en el matraz de fondo redondo. Vórtice vigorosamente la solución a la velocidad máxima, aproximadamente 3.200 rpm, hasta que la película lipídica se separa de la copa, que es observable por el ojo. Transferir la dispersión de lípidos en un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Puesta en marcha de un anillo de soporte para mantener un homogeneizador con una punta de 5 mm. Coloque un soporte debajo de la microcentrífuga homogeneizador para sostener con seguridad la dispersión de lípidos. Enjuague el elemento de dispersión del homogeneizador sumergiendo la punta de 18,2 mW H 2 O y en funcionamiento durante unos segundos. Coloque el elemento de dispersión directamente en la dispersión de lípidos asegurar ªen la punta no toque el fondo del tubo de microcentrífuga. Mezclar durante 1 minuto a potencia 4 ó 14.000 rpm. 4. Extrusión de vesículas y liofilización Montar las partes de la mini-extrusora (Figura 2), que consta de una carcasa exterior y una tuerca de retención que alberga dos membrana interna de teflón apoya, dos juntas tóricas, y un cojinete de teflón. Coloque las dos juntas tóricas en las ranuras de los soportes de membrana internas. Prehumedecido dos filtros y una membrana de 400 nm. Los filtros se colocarán en contra del Teflon interior de las juntas tóricas con la membrana entre ellos. Coloca la membrana apoya en la carcasa exterior extrusora con la membrana rodeada por dos filtros entre en las juntas tóricas. Coloque el cojinete de teflón interior de la carcasa y coloque la tuerca de retención y apriete a mano. Enjuague dos jeringas y llenar uno con 18,2 mW agua. Inserte las agujas de las jeringas en el pequeño holes en el teflón en cada extremo del conjunto de extrusor. Las agujas deben deslizarse con facilidad, no fuerce las agujas. Asegure la extrusora con las jeringas en la carcasa del extrusor y asegurar. Pasar el agua a través de la extrusora empujando lentamente el agua de una jeringa y en el otro. Esto representa un pasaje. Repita el procedimiento para un total de tres pasos necesarios para garantizar que no hay fugas presentes. Retire la jeringa de agua y deseche el agua. Llene una jeringa con la muestra, adjuntar a la extrusora, y pasar lentamente la solución de la vesícula a través de la membrana como se describe anteriormente en el paso 4.3. Repita 10 veces para un total de 11 pasajes. A medida que avanza el proceso de extrusión, la muestra se convertirá en menos turbia y más fácil de empujar a través de la membrana. Una disminución repentina en la resistencia, sin embargo, por lo general indica una ruptura de la membrana. Transferir la solución vesícula extruido y hacer 40 alícuotas de las vesículas en tubos de microcentrífuga.Congelación cada alícuota en cualquier hielo seco o nitrógeno líquido. Liofilizar cada alícuota con un evaporador centrífugo durante la noche a 30 ° C. Guarde las vesículas vacías liofilizadas a -20 ° C. 5. Encapsulación de transcripción-traducción Machinery Mezclar los componentes de la reacción de transcripción-traducción y añadir 20 unidades de inhibidor de RNasa. Incubar en hielo. Añadir la plantilla de ADN. Para una reacción de control, 250 ng de un plásmido de codificación mVenus o una proteína fluorescente similares detrás de un promotor transcripcional T7 y una fuerte E. Se recomienda sitio de unión a ribosoma coli. Llevar el volumen final a 25 l de agua libre de RNasa. Hidratar una alícuota de vesículas liofilizadas (del paso 4.6) con 10 l de la reacción montado en el paso 5.3. Vortex brevemente la mezcla hasta que se vuelven a suspender las vesículas. Esto debería tomar menos de 30 segundos. Incubar la reacción en hielo durante 30 min para permitir que las vesículas se hinchen. Diluir la mezcla de vesículas 20 veces hasta un volumen final de 30 l mediante la adición de 1,5 l de vesículas en 27,0 l de 50 mM de Tris-HCl, 50 mM de NaCl, pH 7,4 y 1,5 l de 20,2 mg / ml de proteinasa K. DNasa y RNasa también se puede añadir en este punto como una alternativa a la proteinasa K para degradar material de extravesicular. Incubar durante al menos 2,5 horas a 37 ° C. 6. Microscopía Examine las vesículas y el progreso de la producción de proteínas fluorescentes en diferentes puntos de tiempo. Las vesículas tendrán un diámetro mayor que los 400 nm de tamaño de poro de la membrana utilizada para la extrusión de las vesículas. Preparar una cámara de muestra, colocando una x 5 mm espaciador 20 de silicio sobre un portaobjetos de microscopio estándar. Pipetear 10 l de vesículas en la cámara de muestra. Coloque una hoja de cubierta de vidrio siliconado sobre la cámara. Tenga en cuenta las vesículas con un aceite de dispersión 63X or objetivo similar de campo claro y microscopía de fluorescencia utilizando el conjunto de filtro apropiado para la proteína fluorescente explotados.

Representative Results

Microscopía de fluorescencia revela que la fluorescencia sólo se observa en el interior de las vesículas, ya que el material extravesicular se degrada enzimáticamente (Figura 3). Para la expresión de mVenus, intravesicular fluorescencia comienza a ser observado después de 1,5 horas a 37 ° C y llega a la intensidad de la fluorescencia máxima dentro de 6 horas. La temperatura óptima y el tiempo de incubación pueden variar dependiendo de los constructos específicos utilizados. Por ejemplo, diferentes proteínas fluorescentes maduran muy diferente en una manera dependiente de la temperatura. En otras palabras, la observación de la producción de proteínas no depende únicamente de la síntesis de proteínas y el plegamiento, pero también en la formación de cromóforo. En general la síntesis de proteína se puede aumentar mediante la incorporación de proteínas de membrana poros para permitir una afluencia de los componentes agotados necesarios para la transcripción y la traducción 27. Se recomienda llevar a cabo un análogo de transcripción-traducciónción de reacción en ausencia de vesículas para asegurar que la construcción genética explotados es funcional. Esta reacción de control se controla más fácilmente por espectroscopia de fluorescencia en lugar de microscopía. Figura 4 muestra in vitro una reacción de transcripción-traducción de una construcción mVenus codificación. Reacciones no encapsulado dan mucho más altas intensidades de fluorescencia totales que las reacciones intravesiculares similares. Esto es debido a la eficiencia de encapsulación y debido a que el volumen total intravesicular es mucho menor que el volumen extravesicular (es decir, un efecto de dilución). Figura 1. El evaporador rotatorio y la bomba de vacío. Haga clic aquí para ver la imagen más grande . <p class="jove_content"fo: keep-together.within-page = "always"> Figura 2. La carcasa y las partes de la extrusora se muestran por separado. De izquierda a derecha, la jeringa, la tuerca de retención, teflón rodamiento, la membrana interna compatible con anillos negros frente a la otra, la caja exterior extrusora y segunda jeringa. Haz clic aquí para ver la imagen más grande . . Figura 3 imágenes de fluorescencia de la producción de proteínas en liposomas mVenus A y C:.. Imágenes de campo claro de vesículas multilamelares después de 1,5 horas y 2,5 horas, y B y# 160, D: La producción de mVenus es visualizado por fluorescencia (color verde) después de 1,5 y 2,5 h, respectivamente. Barra de escala es de 20 micras. Haz clic aquí para ver la imagen más grande . Figura 4. En la reacción de control in vitro de no encapsulada en la transcripción y traducción in vitro de mVenus. La intensidad de fluorescencia se midió cada 5 min durante 4 h. Los datos fueron obtenidos con un instrumento de PCR en tiempo real. Haz clic aquí para ver la imagen más grande .

Discussion

Aunque la biología sintética libre de células se encuentra todavía en su infancia, los avances han establecido una base de la cual se pueden realizar sistemas similares a células cada vez más complejas. La reconstitución de la maquinaria de transcripción-traducción de la definición completa de componentes ⁹ dentro de las vesículas ²⁸ fue particularmente importante para facilitar los esfuerzos posteriores de la construcción artificial sensible ambientalmente cells17, 18. Del mismo modo, los estudios con células artificiales se han utilizado para investigar los procesos evolutivos ^4,29,30, los detalles de la mecánica de ARN y la síntesis de proteínas ^22,31, las influencias de metabólica load32, 33, y el ensamblaje de las partículas virales ^34. Es importante destacar que el conocimiento suficiente ahora existe esa función celular básica se puede reconstituir el interior de vesículas en el laboratorio siguiendo estos informes anteriores y los protocolos descritos en este documento.

Además de ser fácil, la encapsulación se describe procedure tiene varios beneficios. Por ejemplo, muchos, alícuotas liofilizadas vesículas vacías se pueden hacer con antelación y se almacenan a -20 ° C para su uso posterior. El protocolo hace moléculas biológicas que no estén sujetos a los disolventes orgánicos, los cambios drásticos de temperatura, o largos períodos de diálisis. Esperamos que la dulzura del procedimiento facilitará la incorporación de componentes adicionales, según sea necesario. Tampoco hemos observado efectos adversos a los cambios de la composición lipídica de la membrana en la encapsulación o la eficiencia de transcripción-traducción. Por lo tanto, los lípidos más susceptibles a la incorporación de proteínas de membrana, morfologías específicas, o visualización concebiblemente podrían ser explotadas.

La principal limitación del método descrito es que las vesículas resultantes no son homogéneas en tamaño o lamelaridad. Para muchas aplicaciones, estas dificultades no interfieren con la interpretación de los datos. Sin embargo, si es necesario, los pasos adicionales se pueden incorporar a th estrechadistribución de tamaño de correo y disminuir las capas de membranas, tales como nuevas rondas de extrusión después de la encapsulación, congelación-descongelación, o diálisis ^35. Sin duda, los mejores métodos que evitan estos y otros problemas se desarrollarán. Hasta entonces, nos encontramos con el protocolo descrito aquí ser muy adecuado para la construcción de imitadores celulares.

Materials

Quick Spin Mini-prep kit	Qiagen	27104
Spectrometer	NanoDrop 1000	NDB767ND
POPC	Avanti Polar Lipids	770557	MW 760 g/mol Transition Temp -2 °C CAS# 26853-31-6
Ethanol	Sigma Aldrich	459836	Anhydrous, >99.5%
Phenol-choloroform-isoamyl alcohol 25:24:1, for molecular biology use	Sigma Aldrich	P3803-100mL	Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA
Chloroform	Biotech Grade Fluka	496189-1L	Contain ethanol at 0.5-1.0% v/v as stabilizer
Brown amber glass bottles	VWR	89043-518	55X 48 mm
Rotary evaporator	Buchi Rotovapor R-210/Sigma	Z563846EU-1EA	With jack and water bath, 29/32 joint 240 V
Analog vortex mixer	VWR	945300	Speed 1,000-3,200 rpm
Homogenizer	IKA T10 Basic Ultra-Turbax	3420000
Mini-extruder	Avanti Polar Lipids	610020
Extruder filters	Whatman	610014	drain disc 10 mm
Extruder polycarbonate membrane 400 nm	Whatman	61007	nuclepore polycarbonate
Speed vacuum	Labconco	7970011	Centritrap DNA concentrator
PURExpress kit	New England Biolabs	NRM #E6800S
RNAse inhibitor (40,000 U/ml)	New England Biolabs	#M0307S
Proteinase K (20.2 mg/ml)	Fermentas	#EO0491
Microscope	Zeiss Observer Z1with a AxioCam MRm camera
RealTime	CFX96 Real time PCR Detection System (Biorad)
Silicon press to seal  -Molecular Probe	Life Technologies	P18174	Resistant from  -25-30 °C
Siliconized glass circle cover slides	Hampton Research	HR3-231	Diameter= 22 mm
ImageJ	NIH