Endotelial Tubo celular Formação ensaio para a<em> In Vitro</em> Estudo da angiogênese
Summary
O ensaio de formao de tubo é um método rápido, quantificável para medir a angiogénese in vitro. As células endoteliais são combinados com meios condicionados e semeadas em extracto de membrana basal. A formação do tubo ocorre dentro de poucas horas e túbulos recém-formados facilmente quantificada.
Abstract
A angiogénese é um processo fundamental para o desenvolvimento de tecido normal e cicatrização de feridas, mas também está associada a uma variedade de condições patológicas. Utilizando este protocolo, a angiogénese pode ser medida in vitro, de um modo rápido, quantificável. Células endoteliais primárias ou imortalizadas são misturados com meios condicionados e semeadas em matriz de membrana basal. As células endoteliais formam estruturas semelhantes a capilares em resposta a sinais angiogénicos encontrados em meios condicionados. A formação do tubo ocorre rapidamente com células endoteliais começam a alinhar-se dentro de 1 hora e túbulos contendo lúmen começando a aparecer dentro de 2 horas. Os tubos podem ser visualizados utilizando um microscópio invertido de contraste de fase, ou as células podem ser tratadas com calceína AM antes do ensaio e tubos visualizado através de fluorescência ou microscopia confocal. O número de locais de filiais / nós, laços / malhas, o número ou o comprimento dos tubos de formados podem ser facilmente quantificado como uma medida de em VITRo angiogénese. Em resumo, este ensaio pode ser usado para identificar genes e vias que estão envolvidos na promoção ou inibição de angiogénese de um modo rápido, reprodutível e quantitativa.
Introduction
A angiogénese, desenvolvimento de novos vasos sanguíneos a partir de vasos pré-existentes, é essencial para uma variedade de processos, incluindo o crescimento de órgãos, desenvolvimento embrionário, a cicatrização de feridas e 1-3. Recentemente desenvolvido vasos sanguíneos, revestidos por células endoteliais, suprimento de oxigênio e nutrientes para os tecidos, promover a vigilância imunológica por células hematopoiéticas e remover os resíduos 2,4. A angiogênese é de fundamental importância durante o desenvolvimento embrionário e fetal. No entanto, este processo permanece dormente no adulto, exceto durante os períodos de cicatrização de feridas, crescimento esquelético, a gravidez ou durante o ciclo menstrual 1-3.
Ao longo das duas últimas décadas, os mecanismos moleculares fundamentais que regulam a angiogênese começaram a surgir. A angiogênese é um evento estritamente regulado, equilibrado pelo pró e antiangiogênicos sinais incluindo as integrinas, quimiocinas, angiopoietinas, agentes sensores de oxigênio, moléculas juncional e inibidores endógenos 5. Uma vez proangiogenic sinais tais como o factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e factor de crescimento epidérmico (EGF) activam os receptores de células endoteliais nas células endoteliais libertam proteases para degradar a membrana basal. As células endoteliais proliferam em seguida e migram, formando brotos a uma taxa de vários milímetros por 6,7 dias.
A angiogénese está associada a várias condições patológicas, incluindo cancro, psoríase, retinopatia diabética, artrite, asma, doenças auto-imunes, doenças infecciosas, e aterosclerose 8-10. Devido à importância da angiogénese em várias doenças, compreendendo os genes e vias que regulam este processo é crítica para a concepção de melhores terapias.
O ensaio de formao de tubo é um método rápido e quantitativo para a determinação de genes ou vias envolvidas na angiogénese. Descrita pela primeira vez em 1988,os princípios subjacentes a este ensaio são as células endoteliais que retêm a capacidade de dividir e migrar rapidamente, em resposta a sinais angiogénicos 11-13. Além disso, as células endoteliais são induzidas a diferenciar e formar estruturas semelhantes a tubos quando cultivadas numa matriz de extracto de membrana basal (BME). Estes tubos contêm um lúmen rodeado por células endoteliais ligadas entre si por meio de complexos juncionais. A formação do tubo ocorre rapidamente com a maioria dos tubos formando neste ensaio dentro de 2-6 horas, dependendo da quantidade e do tipo de estímulos angiogénicos.
Vários tipos de células endoteliais pode ser utilizado para este ensaio, incluindo ambas as células primárias e as linhas de células imortalizadas 14,15. A linha celular utilizada para este artigo foi rato 3B-11, mas o mesmo método pode ser aplicado a outras linhas de células endoteliais, tais como SVEC4-10 (ratinho) ou células endoteliais primárias, tais como células humanas (HUVEC). Dependendo da linhagem de células é utilizado e se o ce endoteliallls são transformadas ou não transformadas, a optimização necessita de ser realizado para identificar o tempo ideal necessário para a formação do tubo adequado.
Protocol
Representative Results
Discussion
A angiogénese está envolvida em ambos os processos fisiológicos e patológicos. O estudo dos mecanismos envolvidos na angiogénese necessita da utilização de ensaios que recapitulam as etapas principais na angiogénese. O ensaio de formao de tubo endotelial oferece várias vantagens em relação a outros ensaios. É fácil de configurar, é relativamente barato, produz túbulos dentro de horas, e é quantificável. Além disso, pode ser completado em 24 ou placas de 96 poços, e, assim, pode ser utilizado para a tr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo programa do Instituto Nacional do Câncer dos Institutos Nacionais de Saúde Research intramuros, e pelo NCI conceder UA5CA152907.
Materials
| Item | Manufacturer | Catalog # |
| Costar 24-Well Tissue Culture-Treated Plate | Corning | 3524 |
| BD Matrigel Basement membrane matrix, Growth factor reduced | BD Biosciences | 354230 |
| Gibco 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 |
| Gibco L-Glutamine 200mM (100X) | Life Technologies | 25030-081 |
| Gibco Pen Strep | Life Technologies | 15140-122 |
| Gibco DMEM (1X) | Life Technologies | 11965-092 |
| Gibco DPBS (1X) | Life Technologies | 14190-144 |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologicals | F-0500-A |
| Calcein AM | Life Technologies | C3100MP |
| DMSO | ATCC | 4-X |
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