Endotel Hücre için Tüp Deneyi birleşimi<em> İn Vitro</em> Anjiyogenezin Çalışması
Summary
Tüp formasyonu deneyi in vitro olarak anjiyojenezi ölçmek için bir hızlı, ölçülebilir bir yöntemdir. Endotel hücreler, koşullu ortam ile bir araya yerleşen ve bazal zar özü ekilir. Tüp oluşumu saat içinde meydana gelir ve yeni oluşan tübülleri kolayca ölçülebilir.
Abstract
Anjiyogenez normal doku gelişimi ve yara iyileşmesi için önemli bir işlem, aynı zamanda bir çok patolojik durum ile ilişkili bulunmuştur. Bu protokol kullanılarak, anjiyogenez hızlı, ölçülebilir bir şekilde in vitro ölçülebilir. Birincil veya Ölümsüzleştirilmiş endotel hücre koşullu ortam ile karıştırılır ve taban membran matrisi üzerinde plakalanır. Endotel hücreler, koşullu ortam bulunan anjiyojenik sinyallerine yanıt olarak benzeri yapılar kılcal oluştururlar. Tüp oluşumu endotel hücreleri 1 saat ve lümen içeren tübüller 2 saat içinde görünmeye başlıyor içinde kendilerini hizaya başlayan hızlı bir şekilde gerçekleşir. Tüpler, zıt fazlı bir ters mikroskop kullanılarak görüntülenebilir, veya hücreler floresan veya konfokal mikroskobu ile görüntülenir ve borular deneyi öncesinde kalsein AM ile tedavi edilebilir. Şubeleşmiş / düğümleri, sayısı döngüler / kafes ya da numara veya tüplerin oluşan uzunluğunu kolayca vitr içinde bir ölçü olarak tayin edilebilirO anjiyojenez. Özet olarak, bu deney, genler ve hızlı, tekrarlanabilir ve nicel olarak promosyon veya anjiyojenezin inhibisyonuna dahil yolların belirlenmesi için kullanılabilir.
Introduction
Anjiyojenez, önceden mevcut damarlardan yeni kan damarlarının gelişimi, 1-3 iyileşmesi, organ büyüme, embriyonik gelişme ve yara da dahil olmak üzere çeşitli işlemler için hayati önem taşımaktadır. Yeni dokulara endotel hücreleri, tedarik oksijen ve besin sıralandığı kan damarları, geliştirilen, hematopoetik hücreler tarafından immün gözetim teşvik ve atık ürünleri 2,4 çıkarın. Anjiyogenesis embriyonik ve fetal gelişim sırasında kilit öneme sahiptir. Bununla birlikte, bu işlem, yara iyileşmesi, iskelet gelişimi, gebelik zamanlarında dışında veya 1-3 adet döngüsü sırasında yetişkinde çıkamamaktadır.
Son iki yılda, anjiogenezisi düzenleyen önemli moleküler mekanizmalar ortaya çıkmaya başladı. Anjiyogenezis integrinler, kemokin, anjiyopoietinlerin, oksijen algılama ajanlar, kavşak moleküller ve endojen inhibitörleri 5 içeren pro ve antianjiogenik sinyalleri ile dengeli bir sıkı düzenlenmiş olaydır. Proang kezBu tür bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF), vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), platelet türevli büyüme faktörü (PDGF), epidermal büyüme faktörü (EGF) gibi sinyalleri IOGENIC endotelyal hücre endotel hücreleri, temel zara inerek proteazlar serbest reseptörleri aktive eder. Daha sonra endotel hücreleri günde 6,7 ila birkaç milimetre arasında bir oranda lahanası oluşturan çoğalır ve göç eder.
Anjiyogenez, kanser, sedef hastalığı, diyabetik retinopati, artrit, astım, otoimmün hastalıklar, enfeksiyöz hastalıklar ve ateroskleroz da dahil olmak üzere, 8-10, çeşitli patolojik durum ile bağlantılıdır. Nın çeşitli hastalıklarda anjiyojenez önemi, bu işlem daha iyi tedavi edici ilaçların tasarımları için kritiktir düzenleyen genler ve anlamak için yollar.
Tüp tahlili, angiogenesisin oluşumu için gerekli olan genleri veya açık alanlarının belirlenmesi için hızlı ve nicel bir yöntemdir. Üretim 1988 de tarifBu testte oluşturan prensipler endotel hücreleri bölünür ve anjiyojenik sinyal 11-13 yanıt olarak hızlı bir şekilde geçirmek için koruyabilenlerdir bulunmaktadır. Bundan başka, endotel hücrelerinin farklılaşmasına ve bazal zar özü (BME) ihtiva eden bir matris üzerinde kültürlenmiş boru benzeri yapılar oluşturmak için indüklenir. Bu borular bağlantı komplekslerinde yoluyla birbirine bağlanmaktadır ve endotel hücreleri tarafından çevrelenmiş bir lümen içerir. Tüp formasyonu en çok boru miktar ve angiogenik stimuli tipine bağlı olarak 2-6 saat içinde, bu deneyde oluşturan hızlı bir şekilde gerçekleşir.
Endotelyal hücrelerin çeşitli tipleri pil ve ölümsüzleştirilmiş hücre çizgileri 14,15 her iki dahil olmak üzere bu deney için kullanılabilir. Bu makale için kullanılan hücre çizgisi, fare 3B-11, ama aynı yöntemi kullanılarak, HUVEC (insan) hücreleri gibi SVEC4-10 (fare) gibi endotelyal hücre hatları veya primer endotel hücreleri ile uygulanabilir. Hangi bağlı hücre çizgisi kullanılır ve endotel ce oluprf dönüştürülmüş veya non-transforme edilir, optimizasyon uygun tüp oluşumu için gerekli ideal bir zaman belirlemek için yapılan gerekecektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anjiyogenesis fizyolojik ve patolojik süreçlerde hem de yer almaktadır. Angiogenesis ile ilişkili mekanizmaların incelenmesi anjiyojenezde büyük adımlar özetlemek tahlillerin kullanımını gerektirir. Endotel hücre tüp oluşumu tahlil diğer deneylerde fazla birkaç avantaj sunar. Bu, ayarlama kolaydır nispeten pahalı olmayan, birkaç saat içinde tübülleri üretir ve nicelleştirilebilmektedir. Bundan başka, 24 ya da 96 oyuklu plakalar içinde tamamlanabilir ve bu şekilde teşvik faktörleri tanımlam…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü İntramural Araştırma Programı tarafından kısmen desteklenen ve NCI tarafından UA5CA152907 hibe edildi.
Materials
| Item | Manufacturer | Catalog # |
| Costar 24-Well Tissue Culture-Treated Plate | Corning | 3524 |
| BD Matrigel Basement membrane matrix, Growth factor reduced | BD Biosciences | 354230 |
| Gibco 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 |
| Gibco L-Glutamine 200mM (100X) | Life Technologies | 25030-081 |
| Gibco Pen Strep | Life Technologies | 15140-122 |
| Gibco DMEM (1X) | Life Technologies | 11965-092 |
| Gibco DPBS (1X) | Life Technologies | 14190-144 |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologicals | F-0500-A |
| Calcein AM | Life Technologies | C3100MP |
| DMSO | ATCC | 4-X |
Riferimenti
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438, 932-936 (1038).
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, 298-307 (2011).
- Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146, 873-887 (2011).
- Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature. 438, 937-945 (2005).
- Bouis, D., Kusumanto, Y., Meijer, C., Mulder, N. H., Hospers, G. A. A review on pro- and anti-angiogenic factors as targets of clinical intervention. Pharmacological research : the official journal of the Italian Pharmacological Society. 53, 89-103 (2006).
- Ausprunk, D. H., Folkman, J. Migration and proliferation of endothelial cells in preformed and newly formed blood vessels during tumor angiogenesis. Microvascular research. 14, 53-65 (1977).
- Chung, A. S., Lee, J., Ferrara, N. Targeting the tumour vasculature: insights from physiological angiogenesis. Nature reviews. Cancer. 10, 505-514 (2010).
- Chung, A. S., Ferrara, N. Developmental and pathological angiogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 27, 563-584 (2011).
- Kerbel, R. S. Tumor angiogenesis. The New England journal of medicine. 358, 2039-2049 (2008).
- Folkman, J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. The New England journal of medicine. 285, 1182-1186 (1056).
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. The Journal of cell biology. 107, 1589-1598 (1988).
- Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12, 267-274 (2009).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nature protocols. 5, 628-635 (2010).
- Walter-Yohrling, J., et al. Murine endothelial cell lines as models of tumor endothelial cells. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 10, 2179-2189 (2004).
- Connell, K. A., Edidin, M. A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells. Journal of immunology. , 144-521 (1950).
- Carpentier, G. ImageJ contribution: Angiogenesis Analyzer. ImageJ News. , (2012).
