Des cellules endothéliales Tube Formation test pour la<em> In Vitro</em> Etude de l'angiogenèse
Summary
L'essai de formation de tubes est une méthode rapide pour la mesure quantifiable de l'angiogenèse in vitro. Les cellules endothéliales sont combinés avec des milieux conditionnés et étalées sur un extrait de la membrane basale. formation de métro se produit dans les heures et les tubules nouvellement formés facilement quantifiable.
Abstract
L'angiogenèse est un processus essentiel pour le développement normal des tissus et la cicatrisation, mais est également associée à une variété de conditions pathologiques. En utilisant ce protocole, l'angiogenèse peut être mesurée in vitro d'une façon quantifiable rapide. Cellules endothéliales primaires ou immortalisées sont mélangés avec des milieux conditionnés et étalées sur la matrice de la membrane basale. Les cellules endotheliales capillaires forment des structures similaires en réponse à des signaux angiogéniques présents dans des milieux conditionnés. La formation du tube se produit rapidement avec les cellules endothéliales commencent à s'aligner dans 1 heure et tubules contenant lumen-commencent à apparaître dans les 2 heures. Les tubes peuvent être visualisées en utilisant un microscope à contraste de phase inversée, ou les cellules peuvent être traitées avec de la calcéine AM avant l'essai et des tubes visualisé à travers la fluorescence ou microscopie confocale. Le nombre de sites de succursale / nœuds, boucles / mailles, ou le nombre et la durée des tubes formés peuvent être facilement quantifiés comme une mesure de dans vitro angiogenèse. En résumé, ce test peut être utilisé pour identifier les gènes et les voies qui sont impliqués dans la promotion ou l'inhibition de l'angiogenèse d'une manière rapide, reproductible et quantitative.
Introduction
L'angiogenèse, le développement de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants, est vital pour une variété de procédés, y compris la croissance des organes, le développement embryonnaire et la cicatrisation 1-3. Nouvellement développé des vaisseaux sanguins, bordées de cellules endothéliales, de l'oxygène de l'offre et de nutriments aux tissus, de promouvoir la surveillance immunitaire par des cellules hématopoïétiques et éliminer les déchets 2,4. L'angiogenèse est d'une importance capitale au cours du développement embryonnaire et fœtal. Cependant, ce procédé reste en sommeil chez l'adulte, sauf pendant les périodes de cicatrisation des plaies, la croissance du squelette, la grossesse ou au cours du cycle menstruel 1-3.
Au cours des deux dernières décennies, les mécanismes moléculaires clés qui régulent l'angiogenèse ont commencé à émerger. L'angiogenèse est un événement strictement réglementé, pondérées par les signaux pro et anti-angiogéniques dont les intégrines, chimiokines, angiopoïétines, des agents de détection de l'oxygène, des molécules de jonction et les inhibiteurs endogènes 5. Une fois proangsignaux IOGenic tels que facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF), facteur de croissance vasculaire endothélial (VEGF), dérivé des plaquettes facteur de croissance (PDGF) et le facteur de croissance épidermique (EGF), activent des cellules endothéliales des récepteurs des cellules endotheliales libèrent des proteases à dégrader la membrane basale. Les cellules endothéliales prolifèrent et migrent ensuite, former les germes à une vitesse de quelques millimètres par jour 6,7.
L'angiogenèse est associée à divers états pathologiques y compris le cancer, le psoriasis, la rétinopathie diabétique, l'arthrite, l'asthme, les maladies auto-immunes, les maladies infectieuses, l'athérosclérose et 10.8. En raison de l'importance de l'angiogenèse dans diverses maladies, comprenant les gènes et les voies qui régulent ce processus est essentiel pour la conception de meilleurs traitements.
L'essai de formation de tubes est une méthode rapide et quantitative pour la détermination des gènes ou des voies impliquées dans l'angiogenèse. D'abord décrit en 1988,les principes sous-jacents de ce test sont des cellules endothéliales qui conservent la capacité de se diviser et de migrer rapidement en réponse à des signaux angiogéniques 11-13. En outre, les cellules endothéliales sont induites à se différencier et à former des structures en forme de tube quand elle est cultivée sur un extrait de la matrice de la membrane basale (BME). Ces tubes contiennent une lumière entourée par les cellules endothéliales reliées entre elles par des complexes de jonction. Tube de formation se produit rapidement avec la plupart des tubes de formage dans cet essai à l'intérieur de 2 à 6 heures selon la quantité et le type de stimuli angiogéniques.
Plusieurs types de cellules endotheliales peuvent être utilisés pour ce dosage comprenant à la fois des cellules primaires et des lignées cellulaires immortalisées 14,15. La lignée cellulaire utilisée pour cet article était souris 3B-11, mais la même méthode peut être appliquée à d'autres lignées de cellules endothéliales, tels que SVEC4-10 (souris) ou des cellules endotheliales primaires, telles que des cellules HUVEC (humaines). En fonction de la lignée cellulaire est utilisée et si le CE endothélialells sont transformés ou non transformés, l'optimisation devra être menée afin d'identifier le moment idéal nécessaire à la formation correcte de la sonde.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'angiogenèse est impliquée dans les processus physiologiques et pathologiques. Les mécanismes impliqués dans l'angiogenèse étude nécessite l'utilisation de dosages qui récapitulent les principales étapes de l'angiogenèse. L'essai de formation de tubes de cellules endotheliales offre plusieurs avantages par rapport à d'autres essais. Il est facile à mettre en place, est relativement peu coûteux, produit tubules en quelques heures, et est quantifiable. En outre, il peut être complét…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée en partie par le Programme de recherche intra-muros de l'Institut national du cancer des Instituts nationaux de la santé, et par le NCI accorder UA5CA152907.
Materials
| Item | Manufacturer | Catalog # |
| Costar 24-Well Tissue Culture-Treated Plate | Corning | 3524 |
| BD Matrigel Basement membrane matrix, Growth factor reduced | BD Biosciences | 354230 |
| Gibco 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 |
| Gibco L-Glutamine 200mM (100X) | Life Technologies | 25030-081 |
| Gibco Pen Strep | Life Technologies | 15140-122 |
| Gibco DMEM (1X) | Life Technologies | 11965-092 |
| Gibco DPBS (1X) | Life Technologies | 14190-144 |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologicals | F-0500-A |
| Calcein AM | Life Technologies | C3100MP |
| DMSO | ATCC | 4-X |
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