Il saggio di formazione del tubo è un metodo veloce e quantificabili per misurare l'angiogenesi in vitro. Le cellule endoteliali sono combinati con i media condizionati e piastrate su estratto di membrana basale. Formazione del tubo avviene entro ore e tubuli appena formati facilmente quantificabile.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Endoteliali Tubo cellulare saggio Formazione per la
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'angiogenesi è un processo fondamentale per lo sviluppo del tessuto normale e la guarigione della ferita, ma è anche associato con una varietà di condizioni patologiche. Usando questo protocollo, l'angiogenesi può essere misurata in vitro in un veloce, modo quantificabile. Cellule endoteliali primarie o immortalati sono mescolati con i media condizionati e placcato su matrice membrana basale. Le cellule endoteliali formano strutture simili a capillari in risposta ai segnali angiogenici trovati in mezzi condizionati. La formazione del tubo avviene rapidamente con le cellule endoteliali cominciando ad allinearsi entro 1 ora e tubuli-lume contenente cominciando ad apparire in 2 ore. I tubi possono essere visualizzati con un contrasto di fase invertito microscopio, o le cellule possono essere trattate con calceina AM prima del test e tubi visualizzati tramite fluorescenza o confocale. Il numero di siti di filiale / nodi, loop / mesh, o il numero o la lunghezza dei tubi formati può essere facilmente quantificato in una misura di in vitro angiogenesi. In sintesi, questo test può essere utilizzato per identificare i geni e vie che sono coinvolti nella promozione o inibizione dell'angiogenesi in modo rapido, riproducibile, e quantitativa.
Introduzione
L'angiogenesi, lo sviluppo di nuovi vasi sanguigni da vasi preesistenti, è di vitale importanza per una varietà di processi tra cui la crescita di organi, lo sviluppo embrionale, e la guarigione delle ferite 1-3. Recentemente ha sviluppato i vasi sanguigni, rivestiti da cellule endoteliali, l'apporto di ossigeno e sostanze nutritive ai tessuti, promuovere la sorveglianza immunitaria da parte delle cellule ematopoietiche e rimuovere i prodotti di scarto 2,4. L'angiogenesi è di fondamentale importanza durante lo sviluppo embrionale e fetale. Tuttavia, questo processo rimane latente negli adulti eccetto durante i periodi di guarigione d....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1 Raccolta di mezzi condizionati per testare Angiogenic Potenziale
- Crescere cellule primarie o immortalizzate da testare per il potenziale angiogenico o anti-angiogenica nei media siero nativi o basse e raccogliere i media condizionata.
- In alternativa, l'uso condizionato mezzi immediatamente, o aliquotato e conservato a -80 ° C per diversi mesi. Utilizzare nonconditioned supporti siero nativo o partire da un controllo negativo, e usare i media non condizionata completa crescita (10% FBS, o la concentrazione del caso) come controllo positivo. In alternativa, per testare potenziali stimolatori dell'angiogenesi, somministrare carbone mezzi sp....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Mouse 3B-11 cellule endoteliali sono state seminate su solidificato fattore di crescita ridotta BME - in questo saggio, il prodotto Matrigel è stato utilizzato - e seguito nel tempo. Come mostrato in Figura 1, fattori angiogenici secreti da entrambi cheratinociti o fibroblasti di topo sono capaci di indurre la formazione del tubo nel tempo. Le cellule endoteliali migrano e cominciano a formare piccoli rami in 1-2 ore di placcatura. Formazione massima è stato raggiunto 4-6 ore utilizzando mezzi condizion.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
L'angiogenesi è coinvolta nei processi sia fisiologici e patologici. Studiare i meccanismi coinvolti nell'angiogenesi richiede l'uso di saggi che ricapitolano le principali fasi di angiogenesi. Il tubo cellule saggio di formazione endoteliali offre diversi vantaggi rispetto ad altri saggi. E 'facile set-up, è relativamente poco costoso, produce tubuli in poche ore, ed è quantificabile. Inoltre, esso può essere completato in 24 o 96 pozzetti piastre, e quindi può essere utilizzato per lo screening ad alta.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata sostenuta in parte dal programma di ricerca intramurale del National Cancer Institute presso il National Institutes of Health, e NCI concedere UA5CA152907.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Costar Piastra trattata con coltura tissutale a 24 pozzetti | Corning | 3524 | |
| BD Matrigel matrice della membrana basale, fattore di crescita ridotto | BD Biosciences | 354230 | |
| Gibco 0,05% tripsina-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Gibco L-glutammina 200 mM (100x) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Gibco pen strep | Life Tecnologie | 15140-122 | |
| Gibco DMEM (1x) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Gibco DPBS (1x) | Life Technologies | 14190-144 | |
| Siero fetale bovino | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Calcein AM | Life Technologies | C3100MP | |
| DMSO | ATCC | 4-X |
Riferimenti
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438, 932-936 (1038).
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, 298-307 (2011).
- Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
