谱系重编程的成人大脑的周细胞源性细胞诱导成神经细胞
Summary
针对脑固有细胞直接谱系重编程提供了脑修复的新观点。在这里，我们描述了如何准备丰富的文化从成人大脑皮质脑居民周细胞，并通过转录逆转录病毒介导因子的表达Sox2的和ASCL1将这些转换引起的神经元的协议。
Abstract
直接谱系重编程非神经元细胞分化为神经元的诱导（INS）可以提供深入了解相关的神经发生的分子机制，使在体外模型或修复患病的大脑新策略。识别脑居民非神经元细胞类型适合于直接转换成文件可能允许开展这样的做法在原地，IE中的受损脑组织。在这里，我们描述了在确定从成人的大脑是满足这一前提源性干细胞的尝试开发的协议。这个协议包括：人体细胞（1）由从成人的脑活检得到的大脑皮质培养; （2） 体外扩增 （大约需要2-4周），并培养免疫细胞化学表征和流式细胞仪; （3）通过荧光激活细胞分选（FACS），使用抗PDGF受体-β和抗CD146抗体的富集;（4）逆转录病毒介导转导的神经源性转录因子SOX2和ASCL1; （5），最后将得到的周细胞源性诱导的神经元（PdiNs）通过免疫细胞化学的特性（14天至8周下述的逆转录病毒转导）。在这个阶段，INS可以通过膜片钳记录被探测其电气性能。该协议提供了一个高度可重复的程序，对大脑居民周细胞的体外血统转化为功能性人类INS。
Introduction
相对于体细胞成诱导多能干细胞（iPS细胞），这反过来又被赋予了过多的分化潜能的重新编程，直接重编程的目的是为一个特定的信元类型到另一个的直的转换。相对于它们在疾病建模和潜在的基于细胞的疗法的上下文中的应用程序，无论是重新编程的方法具有特殊的优点和缺点。重编程为iPS细胞（i）项规定的细胞几乎无限的来源; （二）允许基因工程; （三）赋予了几乎无限的分化潜能。然而，iPS细胞的主要缺点涉及在未分化的细胞（畸胎瘤形成体内 ）的致瘤性和需要进行离体培养和随后的移植的风险，如果这些细胞将被用于基于细胞的疗法。相反，直接谱系重编程是由所需的细胞的产量较低限制这直接关联与起始种群的靶细胞的数量，但具有该谱系重编程的细胞出现移植1,2时表现出无致瘤性风险的优点;此外，直接重新编程，甚至可以在原位实现， 即在其中将需要这些细胞，从而避免移植的必要性的器官。
考虑到这一点，我们的实验室一直奉行谱系重编程脑固有细胞的可能性为插件作为对神经退行性疾病的细胞疗法的一种新方法。这可能会潜在地视为谱系重编程细胞靶点脑固有细胞包括不同类型胶质细胞的（星形胶质细胞，NG2细胞和少突胶质细胞），小胶质细胞和微血管相关的细胞（内皮细胞和周细胞）。我们已经广泛地研究了大脑皮质的星形胶质细胞的体外重编程的潜力TEX出生后早期小鼠3-5。在寻找类似的合适的细胞来源，可直接谱系重编程在成人的大脑，我们遇到了一个细胞群，可以成功地重编程为INS和周的展览标志。这里，我们描述了如何从成人脑活检收获这些细胞中，以扩大和体外富集这些细胞，并最终成功地重新编程这些体外扩增的细胞的主要部分（在25-30％的范围内）到一个协议INS。重新编程可通过同时逆转录病毒介导的共表达两种转录因子，SOX2和ASCL1来实现。这些PdiNs被发现收购重复性动作电位射击的能力，并作为突触目标，其他神经元表明其整合到神经网络的能力。我们的协议提供了一个简单程序的隔离和传承转换成人的大脑周细胞成文件。 </P>
Protocol
Representative Results
Discussion
本协议描述了在体外扩增和富集周细胞来源的细胞从以下的成年人的大脑皮层分离和随后转化成INS由神经源性转录的逆转录病毒介导的表达Sox2的因素和ASCL1。这种协议提供了实验体外系统研究谱系转换的脑居民细胞向神经元可能还有神经胶质细胞，用共同的目标，最终把这种直接转换方法为成人大脑的体内环境。
技术考虑
在我们的研究?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们非常感谢马格达莱纳格茨博士对本协议的发展过程中她的投入。我们感谢马吕斯Wernig博士（斯坦福大学）慷慨地为我们提供了SOX2编码序列。我们也非常感谢亚历山大Lepier博士病毒的生产。这项工作是由德意志研究联合会（BE 4182/2-2）和BMBF（01GN1009A）至BB，和科学的巴伐利亚州部，研究和艺术，以MK和BBCS收到资金来自两个民族SYSTHER-的资金支持INREMOS虚拟学院（德国和斯洛文尼亚联邦部委教育及研究）及东风集团（SFB 824）。
Materials
| anti-CD140b-PE | BD Biosciences | 558821 | use 1:100 |
| anti-CD146-FITC | AbD Serotec | MCA2141FT | use 1:100 |
| anti-CD13-FITC | AbD Serotec | MVA1270A488T | use 1:100 |
| anti-CD34-APC | BD Biosciences | 560940 | use 1:100 |
| anti-PDGFRβ | Cell Signaling | 3169S | use 1:200 |
| anti-CD146 | Abcam | Ab75769 | use 1:400 |
| anti-NG2 | Millipore | AB5320 | use 1:400 |
| anti-SMA | Sigma-Aldrich | A2547 | use 1:400 |
| anti-βIII-tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | use 1:400 |
| anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M4403 | use 1:200 |
| anti-GFAP | Sigma-Aldrich | G3893 | use 1:600 |
| anti-GFP | Aves Labs | GFP 10-20 | use 1:1000 |
| anti-RFP | Chromotek | 5F8 | use 1:500 |
| anti-S100β | Sigma-Aldrich | S2532 | use 1:300 |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 | use 1:200 |
| anti-GABA | Sigma-Aldrich | A2052 | use 1:500 |
| anti-Calretinin | Millipore | AB5054 | use 1:500 |
| anti-vGluT1 | SYnaptic SYstems | 135511 | use 1:1000 |
| Rat IgG1 isotype control FITC | AbD Serotec | 11-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control PE | AbD Serotec | 12-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control APC | AbD Serotec | 17-4301-81 | use 1:100 |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10106-169 | perform heat inactivation by incubation at 56 °C for 30 min |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) | Invitrogen | 24020-091 | |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1×; Invitrogen, cat. no. 14190) | Invitrogen | 14190 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| PFA (paraformaldehyde) | Sigma-Aldrich | P1648 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate | Sigma-Aldrich | 042M4005 | |
| Aqua-Poly/Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap | BD Biosciences | 352235 | |
| 24-well plates | Orange Scientific | 5530305 | |
| 75 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 | |
| 25 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 690175 | |
| Disposable pipettes 10 ml | Sarstedt | ######### | |
| Glass Pasteur pipettes (150 mm) | Fisherbrand | FB50251 | |
| Glass coverslips 12 mm diameter | Menzel | CB00120RA1 | |
| Surgical disposable scalpels | B. Braun | 5518083 | |
| Tissue culture dishes | Greiner Bio-One | 633180 | |
| Conical tubes 15ml | BD Biosciences | 352095 | |
| Laminar flow hood | |||
| Centrifuge and swing-out rotor with adapters for 15 ml and 50 ml tubes | Hettich Lab Technology | 1406 | |
| Flow cytometry cell sorter: FACSAria l with FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Humified cell culture incubator | Eppendorf Galaxy 170R | ||
| Wather bath at 37 °C | |||
| FACSFlow sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| Epifluorescence microscope BX61 | Olympus | ||
| Confocal microscope LSM710 | Zeiss |
Riferimenti
- Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
- Kim, J., et al. Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse fibroblasts. Cell stem cell. 9, 413-419 (2011).
- Duan, B., et al. Interactions between water deficit, ABA, and provenances in Picea asperata. Journal of experimental botany. 58, 3025-3036 (2007).
- Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biol. 8, (2010).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat Protoc. 6, 214-228 (2011).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. , (2007).
- Karow, M., et al. Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells. Cell stem cell. 11, 471-476 (2012).
- Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6, 1847-1859 (2011).
- Ladewig, J., et al. Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts. Nat Methods. 9, 575-578 (2012).
- Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).
- Davila, J., Chanda, S., Ang, C. E., Sudhof, T. C., Wernig, M. Acute reduction in oxygen tension enhances the induction of neurons from human fibroblasts. J Neurosci Methods. 216, 104-109 (2013).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463, 1035-1041 (2010).
- Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 10343-10348 (2011).
- Lu, J., et al. Generation of Integration-free and Region-Specific Neural Progenitors from Primate Fibroblasts. Cell Rep. 3, 1580-1591 (2013).
- Yang, N., Ng, Y. H., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M. Induced neuronal cells: how to make and define a neuron. Cell Stem Cell. 9, 517-525 (2011).
- Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476, 220-223 (2011).
- Yoo, A. S., et al. MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons. Nature. 476, 228-231 (2011).
- Son, E. Y., et al. Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons. Cell Stem Cell. 9, 205-218 (2011).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 2527-2532 (2012).
- Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10, 473-479 (2012).
- Yang, N., et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nat Biotechnol. 31, 434-439 (2013).
- Najm, F. J., et al. Transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to expandable, myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells. Nat Biotechnol. 31, 426-433 (2013).
