Lineage-herprogrammering van pericyte-afgeleide cellen van het volwassen menselijke hersenen in Induced Neuronen
Summary
Targeting hersen-ingezeten cellen voor directe afstamming-herprogrammering biedt nieuwe perspectieven voor de hersenen reparatie. Hier beschrijven we een protocol hoe culturen verrijkt voor hersen-ingezeten pericytes van de menselijke hersenschors volwassen opstellen en deze om te zetten naar geïnduceerde neuronen door-retrovirus gemedieerde expressie van de transcriptiefactoren Sox2 en Ascl1.
Abstract
Directe lijn-herprogrammering van niet-neuronale cellen in geïnduceerde neuronen (INS) kan inzicht geven in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen neurogenese en maken nieuwe strategieën voor in vitro modellen of repareren van de zieke hersenen. Het identificeren van de hersenen-ingezeten niet-neuronale celtypes vatbaar voor directe omzetting in iNs zou kunnen stellen voor de lancering van een dergelijke aanpak in situ, dat wil zeggen binnen het beschadigde hersenweefsel. Hier beschrijven we een protocol ontwikkeld in de poging identificeren cellen afkomstig van de volwassen menselijke hersenen die dit uitgangspunt voldoen. Dit protocol omvat: (1) het kweken van menselijke cellen uit de cerebrale cortex, verkregen uit volwassen menselijke hersenen biopten; (2) het in vitro expansie (ongeveer ter 2-4 weken) en karakterisatie van de cultuur door immunocytochemie en flowcytometrie; (3) de verrijking door fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) met anti-PDGF-receptor-β en anti-CD146 antilichamen;(4) de-retrovirus bemiddelde transductie met de neurogene transcriptiefactoren Sox2 en ascl1; (5) en tenslotte de karakterisering van de verkregen pericyte-afgeleide neuronen geïnduceerde (PdiNs) met immunocytochemie (14 dagen tot 8 weken na retrovirale transductie). In dit stadium kan iNs worden gesondeerd voor hun elektrische eigenschappen van patch-clamp opname. Dit protocol verschaft een reproduceerbare werkwijze voor de in vitro lijn omzetting van hersen-resident pericyten in functionele menselijke iNs.
Introduction
In tegenstelling tot herprogrammering van somatische cellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs), die op hun beurt zijn begiftigd met een overvloed aan differentiatie potentieel, directe herprogrammering beoogt rechte omzetting van een specifiek celtype in een ander. Met betrekking tot hun toepassing in de context van ziektemodel en potentiële cellen gebaseerde therapieën, zowel herprogrammering benaderingen hebben specifieke voor-en nadelen. Herprogrammeren in iPSCs (i) biedt een vrijwel oneindige bron van cellen; (Ii) maakt genetische manipulatie; (Iii) schenkt met een bijna onbeperkt differentiatie potentieel. Echter grote nadelen van iPSCs brengen het risico van tumorgeniciteit van de ongedifferentieerde cellen (teratomavorming in vivo) en de noodzaak voor ex vivo kweken en worden verplant als deze cellen worden gebruikt voor cellen gebaseerde therapieën. Omgekeerd is direct afstammings-herprogrammering beperkt door de lagere opbrengst van de gewenste cellendie rechtstreeks correleert met het aantal van de doelcellen van de uitgangspopulatie, maar bezit het voordeel dat-lijn geherprogrammeerd cellen blijken geen tumorigene risico vertonen op transplantatie 1,2; bovendien kan direct herprogrammering ook worden bereikt in situ, dat wil zeggen binnen het orgaan waar deze cellen vereist zou zijn, waardoor de noodzaak van transplantatie voorkomen.
Met dit in het achterhoofd, heeft ons lab de mogelijkheid van-lijn herprogrammeren hersen-ingezeten cellen nagestreefd in iNs als nieuwe benadering in de richting van cel-gebaseerde therapieën van neurodegeneratieve ziekten. Brain gevestigde cellen die mogelijk kunnen worden beschouwd als cellulaire doelwitten voor afstammings-herprogrammering omvatten verschillende macroglia (astrocyten, NG2 cellen en oligodendrocyten), microglia, en microvaatje geassocieerde cellen (endotheelcellen en pericyten). Wij hebben uitgebreid bestudeerd in vitro potentie van astroglia herprogrammering van de cerebrale cortex van de vroege postnatale muizen 3-5. Op zoek evenzo geschikte cel bronnen voor directe afstamming-herprogrammering in het volwassen menselijk brein, we tegenkwamen een celpopulatie die met succes kan worden geprogrammeerd in de ins en vertonen kenmerken van pericytes. Hier een protocol hoe deze cellen oogsten van volwassen menselijke hersenen biopsieën, uitbreiden en verrijken deze cellen in vitro, en tenslotte succes herprogrammeren een aanzienlijke fractie van deze in vitro geëxpandeerde cellen (in het traject van 25-30%) in beschrijven we INS. Herprogrammering kan door gelijktijdige retrovirus-gemedieerde co-expressie van twee transcriptiefactoren, Sox2 en ascl1. Deze PdiNs bleken het vermogen van repetitieve actiepotentiaal afvuren verwerven en synaptische als doelwitten dienen voor andere neuronen vermelding van hun vermogen integreren in neurale netwerken. Het protocol biedt een eenvoudige procedure voor de isolatie en geslacht omzetting van volwassen menselijke hersenen pericyten in iNs. </p>
Protocol
Representative Results
Discussion
Het huidige protocol beschrijft de in vitro uitbreiding en verrijking van-pericyte afgeleide cellen na isolatie van de menselijke hersenschors volwassen en de daaropvolgende omzetting in iNs door-retrovirus gemedieerde expressie van de neurogene transcriptiefactoren Sox2 en Ascl1. Een dergelijk protocol voorziet in een experimenteel in vitro systeem om de lijn-omzetting van hersen-ingezeten cellen in neuronen en mogelijk ook glia bestuderen, met het doel voor ogen om uiteindelijk vertalen deze directe …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn dankbaar dat dr. Magdalena Götz voor haar inbreng tijdens de ontwikkeling van dit protocol. Wij danken dr. Marius Wernig (Stanford University) voor royaal verstrekken van ons met de Sox2 coderende sequentie. We zijn ook zeer dankbaar Dr Alexandra Lepier voor virus productie. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (BE 4182/2-2) en het BMBF (01GN1009A) naar BB, en het Beierse ministerie van Wetenschappen, Onderzoek en Kunst naar MK en BBCS ontving gelden van de binationale SYSTHER- INREMOS Virtual Institute (Duitse en Sloveense federale ministeries van Onderwijs en Onderzoek) en de DFG (SFB 824).
Materials
| anti-CD140b-PE | BD Biosciences | 558821 | use 1:100 |
| anti-CD146-FITC | AbD Serotec | MCA2141FT | use 1:100 |
| anti-CD13-FITC | AbD Serotec | MVA1270A488T | use 1:100 |
| anti-CD34-APC | BD Biosciences | 560940 | use 1:100 |
| anti-PDGFRβ | Cell Signaling | 3169S | use 1:200 |
| anti-CD146 | Abcam | Ab75769 | use 1:400 |
| anti-NG2 | Millipore | AB5320 | use 1:400 |
| anti-SMA | Sigma-Aldrich | A2547 | use 1:400 |
| anti-βIII-tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | use 1:400 |
| anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M4403 | use 1:200 |
| anti-GFAP | Sigma-Aldrich | G3893 | use 1:600 |
| anti-GFP | Aves Labs | GFP 10-20 | use 1:1000 |
| anti-RFP | Chromotek | 5F8 | use 1:500 |
| anti-S100β | Sigma-Aldrich | S2532 | use 1:300 |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 | use 1:200 |
| anti-GABA | Sigma-Aldrich | A2052 | use 1:500 |
| anti-Calretinin | Millipore | AB5054 | use 1:500 |
| anti-vGluT1 | SYnaptic SYstems | 135511 | use 1:1000 |
| Rat IgG1 isotype control FITC | AbD Serotec | 11-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control PE | AbD Serotec | 12-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control APC | AbD Serotec | 17-4301-81 | use 1:100 |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10106-169 | perform heat inactivation by incubation at 56 °C for 30 min |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) | Invitrogen | 24020-091 | |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1×; Invitrogen, cat. no. 14190) | Invitrogen | 14190 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| PFA (paraformaldehyde) | Sigma-Aldrich | P1648 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate | Sigma-Aldrich | 042M4005 | |
| Aqua-Poly/Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap | BD Biosciences | 352235 | |
| 24-well plates | Orange Scientific | 5530305 | |
| 75 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 | |
| 25 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 690175 | |
| Disposable pipettes 10 ml | Sarstedt | ######### | |
| Glass Pasteur pipettes (150 mm) | Fisherbrand | FB50251 | |
| Glass coverslips 12 mm diameter | Menzel | CB00120RA1 | |
| Surgical disposable scalpels | B. Braun | 5518083 | |
| Tissue culture dishes | Greiner Bio-One | 633180 | |
| Conical tubes 15ml | BD Biosciences | 352095 | |
| Laminar flow hood | |||
| Centrifuge and swing-out rotor with adapters for 15 ml and 50 ml tubes | Hettich Lab Technology | 1406 | |
| Flow cytometry cell sorter: FACSAria l with FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Humified cell culture incubator | Eppendorf Galaxy 170R | ||
| Wather bath at 37 °C | |||
| FACSFlow sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| Epifluorescence microscope BX61 | Olympus | ||
| Confocal microscope LSM710 | Zeiss |
Riferimenti
- Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
- Kim, J., et al. Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse fibroblasts. Cell stem cell. 9, 413-419 (2011).
- Duan, B., et al. Interactions between water deficit, ABA, and provenances in Picea asperata. Journal of experimental botany. 58, 3025-3036 (2007).
- Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biol. 8, (2010).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat Protoc. 6, 214-228 (2011).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. , (2007).
- Karow, M., et al. Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells. Cell stem cell. 11, 471-476 (2012).
- Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6, 1847-1859 (2011).
- Ladewig, J., et al. Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts. Nat Methods. 9, 575-578 (2012).
- Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).
- Davila, J., Chanda, S., Ang, C. E., Sudhof, T. C., Wernig, M. Acute reduction in oxygen tension enhances the induction of neurons from human fibroblasts. J Neurosci Methods. 216, 104-109 (2013).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463, 1035-1041 (2010).
- Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 10343-10348 (2011).
- Lu, J., et al. Generation of Integration-free and Region-Specific Neural Progenitors from Primate Fibroblasts. Cell Rep. 3, 1580-1591 (2013).
- Yang, N., Ng, Y. H., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M. Induced neuronal cells: how to make and define a neuron. Cell Stem Cell. 9, 517-525 (2011).
- Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476, 220-223 (2011).
- Yoo, A. S., et al. MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons. Nature. 476, 228-231 (2011).
- Son, E. Y., et al. Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons. Cell Stem Cell. 9, 205-218 (2011).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 2527-2532 (2012).
- Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10, 473-479 (2012).
- Yang, N., et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nat Biotechnol. 31, 434-439 (2013).
- Najm, F. J., et al. Transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to expandable, myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells. Nat Biotechnol. 31, 426-433 (2013).
