Lineage-перепрограммирование перицитов клеток, полученных из взрослых мозга человека в индуцированные нейронов
Summary
Ориентация мозга резидентом клетки для прямого Lineage-перепрограммирования открывает новые перспективы для ремонта мозга. Здесь мы опишем протокол о том, как подготовить культур, обогащенных для мозга резидентом перицитами от взрослого головного мозга человека и преобразовать их в индуцированные нейронов ретровируса-опосредованной экспрессии факторов транскрипции Sox2 и Ascl1.
Abstract
Прямая линия-перепрограммирование не-нервных клеток в индуцированные нейронов (INS) может дать ответ на молекулярных механизмов, лежащих в основе нейрогенез и включить новые стратегии для моделирования в пробирке или ремонта больной мозг. Определение мозга-нерезидентные нейронные типы клеток, поддающиеся прямого преобразования в INS может позволить для запуска такой подход на месте, то есть в течение поврежденной ткани головного мозга. Здесь мы опишем протокол, разработанный в попытке идентификации клеток, полученных из взрослого человеческого мозга, что выполнить это помещение. Этот протокол включает в себя: (1) культивирование клеток человека из коры головного мозга, полученных из взрослых биопсии головного мозга человека; (2) расширение в пробирке (приблизительно требуя 2-4 недели) и характеристика культуры по иммуноцитохимии и проточной цитометрии; (3) обогащение с помощью флуоресцентной активированный сортировки клеток (FACS) с использованием анти-PDGF рецептор-β и анти-CD146 антитела;(4) ретровирус-опосредованного трансдукции с нейрогенной факторов транскрипции Sox2 и ascl1; (5) и, наконец, характеристика полученных перицитами полученных индуцированных нейронов (PdiNs) по иммуноцитохимии (14 дней до 8 недель после ретровирусную трансдукции). На данном этапе, модули могут быть проверены их электрических свойств по записи патч-зажим. Этот протокол обеспечивает высокую воспроизводимость порядок в пробирке клонов преобразования мозга резидентом перицитами на функциональные человека INS.
Introduction
В отличие от перепрограммирования соматических клеток в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), которые в свою очередь, наделенных множеством дифференциальным потенциалом, прямой перепрограммирование стремится к прямой конвертации одного конкретного типа клеток в другой. В отношении их применения в контексте моделирования болезней и потенциальных клеточной терапии, оба подхода перепрограммирования имеют свои преимущества и недостатки. Перепрограммирование в ИПСК (I) обеспечивает практически бесконечный источник клеток; (II) позволяет генной инженерии; (III) наделяет почти неограниченным потенциалом дифференцировки. Тем не менее, основные недостатки ИПСК влекут за собой риск туморогенность из недифференцированных клеток (образование тератомы в естественных условиях) и необходимости экс естественных условиях выращивания и последующей трансплантации, если эти клетки будут использоваться для клеточной терапии. С другой стороны, линия прямой-перепрограммирование ограничена нижней выход целевого клетокчто коррелирует непосредственно с количеством целевых клеток исходной популяции, но обладает тем преимуществом, что Lineage-перепрограммировать клетки-видимому, не обладают не онкогенного риска после трансплантации 1,2; Кроме того, прямое перепрограммирование даже может быть достигнуто на месте, то есть внутри органа, где эти клетки потребовалось бы, таким образом избегая необходимости трансплантации.
Имея это в виду, наша лаборатория проводит возможность клон-перепрограммирования мозга резидентом клеток в INS в качестве нового подхода к основе клеток терапии нейродегенеративных заболеваний. Мозг-резидентом клетки, которые потенциально могут быть рассмотрены как клеточных мишеней для Lineage-перепрограммирования включают различные типы макроглии (астроциты, NG2 клеток и олигодендроцитов), микроглии и микрососудов связанных клеток (эндотелиальных клеток и перицитов). Мы всесторонне изучают в пробирке перепрограммирования потенциал астроглии головного кортекс раннего послеродового мышей 3-5. В поисках же подходящих источников клеток для прямого Lineage-перепрограммирования во взрослом мозге человека, мы столкнулись с клеточной популяции, которые могут быть успешно перепрограммировать в входы и выставочных признаков перицитами. Здесь мы описываем протокол, как собрать эти клетки от взрослых биопсии головного мозга человека, расширить и обогатить эти клетки в пробирке, и, наконец, успешно перепрограммировать значительную часть этих расширенных в пробирке клеток (в диапазоне 25-30%) в дюймов Перепрограммирование может быть достигнуто путем одновременного опосредованного ретровирусом совместной экспрессии двух факторов транскрипции, Sox2 и ascl1. Эти PdiNs были найдены приобрести способность повторяющиеся потенциала действия стрельбы и служить синаптические цели для других нейронов с указанием их способность интеграции в нейронных сетях. Наш протокол обеспечивает простой процедуры для изоляции и рода превращения взрослых перицитами мозга человека в INS. </р>
Protocol
Representative Results
Discussion
Настоящий протокол описывает расширение в пробирке и обогащение перицитами клеток, полученных следующий изоляции от взрослого головного мозга человека и последующее преобразование в INS по ретровируса-опосредованной экспрессии нейрогенной транскрипционных факторов Sox2 и Ascl1. Та?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны доктору Магдалена Гетц для ее ввода в процессе разработки этого протокола. Мы благодарим доктора Marius Wernig (Стэнфордский университет) за щедрое предоставляя нам последовательности Sox2 кодирования. Мы также очень благодарны доктору Александра Lepier для производства вируса. Эта работа была поддержана грантами Deutsche Forschungsgemeinschaft (BE 4182/2-2) и BMBF (01GN1009A) до BB, и Баварским государственным министерством наук, исследований и искусства в МК и BBCs получил финансирование от двухнационального SYSTHER- INREMOS Виртуальный институт (немецкий и словенский Федеральные министерства образования и научных исследований) и DFG (SFB 824).
Materials
| anti-CD140b-PE | BD Biosciences | 558821 | use 1:100 |
| anti-CD146-FITC | AbD Serotec | MCA2141FT | use 1:100 |
| anti-CD13-FITC | AbD Serotec | MVA1270A488T | use 1:100 |
| anti-CD34-APC | BD Biosciences | 560940 | use 1:100 |
| anti-PDGFRβ | Cell Signaling | 3169S | use 1:200 |
| anti-CD146 | Abcam | Ab75769 | use 1:400 |
| anti-NG2 | Millipore | AB5320 | use 1:400 |
| anti-SMA | Sigma-Aldrich | A2547 | use 1:400 |
| anti-βIII-tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | use 1:400 |
| anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M4403 | use 1:200 |
| anti-GFAP | Sigma-Aldrich | G3893 | use 1:600 |
| anti-GFP | Aves Labs | GFP 10-20 | use 1:1000 |
| anti-RFP | Chromotek | 5F8 | use 1:500 |
| anti-S100β | Sigma-Aldrich | S2532 | use 1:300 |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 | use 1:200 |
| anti-GABA | Sigma-Aldrich | A2052 | use 1:500 |
| anti-Calretinin | Millipore | AB5054 | use 1:500 |
| anti-vGluT1 | SYnaptic SYstems | 135511 | use 1:1000 |
| Rat IgG1 isotype control FITC | AbD Serotec | 11-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control PE | AbD Serotec | 12-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control APC | AbD Serotec | 17-4301-81 | use 1:100 |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10106-169 | perform heat inactivation by incubation at 56 °C for 30 min |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) | Invitrogen | 24020-091 | |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1×; Invitrogen, cat. no. 14190) | Invitrogen | 14190 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| PFA (paraformaldehyde) | Sigma-Aldrich | P1648 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate | Sigma-Aldrich | 042M4005 | |
| Aqua-Poly/Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap | BD Biosciences | 352235 | |
| 24-well plates | Orange Scientific | 5530305 | |
| 75 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 | |
| 25 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 690175 | |
| Disposable pipettes 10 ml | Sarstedt | ######### | |
| Glass Pasteur pipettes (150 mm) | Fisherbrand | FB50251 | |
| Glass coverslips 12 mm diameter | Menzel | CB00120RA1 | |
| Surgical disposable scalpels | B. Braun | 5518083 | |
| Tissue culture dishes | Greiner Bio-One | 633180 | |
| Conical tubes 15ml | BD Biosciences | 352095 | |
| Laminar flow hood | |||
| Centrifuge and swing-out rotor with adapters for 15 ml and 50 ml tubes | Hettich Lab Technology | 1406 | |
| Flow cytometry cell sorter: FACSAria l with FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Humified cell culture incubator | Eppendorf Galaxy 170R | ||
| Wather bath at 37 °C | |||
| FACSFlow sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| Epifluorescence microscope BX61 | Olympus | ||
| Confocal microscope LSM710 | Zeiss |
Riferimenti
- Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
- Kim, J., et al. Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse fibroblasts. Cell stem cell. 9, 413-419 (2011).
- Duan, B., et al. Interactions between water deficit, ABA, and provenances in Picea asperata. Journal of experimental botany. 58, 3025-3036 (2007).
- Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biol. 8, (2010).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat Protoc. 6, 214-228 (2011).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. , (2007).
- Karow, M., et al. Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells. Cell stem cell. 11, 471-476 (2012).
- Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6, 1847-1859 (2011).
- Ladewig, J., et al. Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts. Nat Methods. 9, 575-578 (2012).
- Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).
- Davila, J., Chanda, S., Ang, C. E., Sudhof, T. C., Wernig, M. Acute reduction in oxygen tension enhances the induction of neurons from human fibroblasts. J Neurosci Methods. 216, 104-109 (2013).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463, 1035-1041 (2010).
- Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 10343-10348 (2011).
- Lu, J., et al. Generation of Integration-free and Region-Specific Neural Progenitors from Primate Fibroblasts. Cell Rep. 3, 1580-1591 (2013).
- Yang, N., Ng, Y. H., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M. Induced neuronal cells: how to make and define a neuron. Cell Stem Cell. 9, 517-525 (2011).
- Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476, 220-223 (2011).
- Yoo, A. S., et al. MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons. Nature. 476, 228-231 (2011).
- Son, E. Y., et al. Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons. Cell Stem Cell. 9, 205-218 (2011).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 2527-2532 (2012).
- Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10, 473-479 (2012).
- Yang, N., et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nat Biotechnol. 31, 434-439 (2013).
- Najm, F. J., et al. Transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to expandable, myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells. Nat Biotechnol. 31, 426-433 (2013).
