内吞体动力学在生活神经末梢与四维荧光成像可视化
Summary
四维（4D）成像被用于研究中两种类型的核内体的活的脊椎动物神经终端的行为和交互作用。这些小的结构的运动的特征是在三维空间中，从而允许确认如内涵体融合和胞吐作用的事件。
Abstract
四维（4D）光成像已被用于薄的横运动神经末梢内学习的小结构腹行为的袜带蛇的肌肉。原始数据包括3D Z-堆栈延时序列。每个堆栈包含在由400-1,500 nm的分离焦平面收购与萤光光学4-20图像。在采集图像栈，如调整聚焦的步骤，切换激发波长，并在数码相机的操作，是自动的，尽可能最大化图像率和最小化从光照射的组织损伤。采集后，一组图像栈的去卷积，以提高空间分辨率，转化成所需的3D格式，并用于创建4D“电影”，是适合各种基于计算机的分析，这取决于所寻求的实验数据。一个应用是两个阶级内涵体的神经末梢，macroendosomes发现（MES）的动态行为的研究和酸性核内体（AES），其大小（200-800纳米的两种类型）是在或接近衍射极限。获得在每个时间点的三维信息提供了几个优点优于常规延时成像。特别是，规模和结构的运动速度可以一次进行量化比没有的大家关注的焦点损失。从四维成像数据的例子揭示的ME接近质膜和消失，这表明它们是胞吐而不是简单的垂直移动远离焦点的单个平面上。还透露，是公认的融合的ME和AE的，如通过在三个正交投影观看两个含染料结构之间的重叠可视化。
Introduction
活体组织的时间推移成像提供可视化访问动力学结构与功能的关系，不能在成像在单个时间点固定或生活准备将不胜感激。然而，通常的折衷访问的时间信息是在光学分辨率的降低。高数值孔径的油浸目标是因为它们的窄的范围内聚焦的不切实际的活组织，留下水浸泡或干的目标是唯一的选择。此外，通过共聚焦光学系统所带来的增加的分辨率不能被使用在一些生活制剂因光毒性的相对较高水平照明的所需1,2。最后，虽然几个实时或延时的光学技术是可用的提供增强的分辨率，其适用性是有限的制剂，其中感兴趣的结构可以被定位在目标1的几百纳米。中记载的方法使得使用相对低成本的设备，具有通用性，还提供了改进的分辨率相比，更常用的时移技术。它的目的是用于个人实验室以及成像设施。
该方法利用常规落射荧光显微镜，结合一个灵敏的数字照相机和与硬件设计来快速地获得图像集在稍微不同的焦平面（Z-堆栈）。每个z-堆栈数字去卷积，以提高分辨率。三维时间推移（4D）成像的一个特点是移动的细胞器或其他结构的精确跟踪。当正确设置，成像结构不出去的焦点，并在所有三个方向的运动可以观察和量化。因而这是不可能的染色后的结构消失在一个或多个时移的帧仅通过漂流的上方或下方的窄焦平面。该方法也可作为一个敏感的工具，以评估的相互作用和可能的复锡永的小结构。常规落射荧光或接近衍射极限（几百纳米）的结构的共焦图象不确认融合即使合并的图像显示，它们各自的标签3的重叠。融合建议，但它仍然是可能的目的是通过一个距离，该距离低于衍射极限水平或垂直方向分隔开。三或四维成像，相反，允许观看在三个正交方向上的对象。融合在所有三个视图的外观增加了确定性的水平。而且，在一些生活的准备，指挥或推定融合对象的布朗运动提供了进一步的证据时，这两个标签一起移动的时间。当然，当接近衍射极限的确定性在从背景拘泥的结构，或表明它们含有两种染料（融合）的水平，也不是绝对的。如果适用的话，专门技术，如荧光共振能量转移（FRET）4，是比较合适的。
Protocol
Representative Results
Discussion
四维成像的最重要方面是光线照射的持续时间和强度的管理。光漂白减小图像信号与噪声的比，并且可以是有问题的或不依赖于多种因素，包括选择的荧光团。到生物体组织（光毒性）的非特异性损伤有关，光漂白，并且有时可以使用为目的而设计2,12或通过检查形态与合适的明场光学，如微分干涉对比（DIC）的荧光探针来识别。
这是可能的，但是，以诱导发生在光?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由卫生部资助NS-024572（至RSW）美国国家研究院的支持。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents: | |||
| SGC5 | Biotium [Hayward, CA] | 70057 | Final conc:10 mM |
| FM1-43FX | Invitrogen [Carlsbad, CA] | F35335 | Final conc:7 mM |
| LysoTracker Red | Invitrogen [Carlsbad, CA] | L7528 | Final conc:0.2 mM |
| Solutions: | |||
| Reptilian Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 145 mM | ||
| KCl | 2.5 mM | ||
| CaCl2 | 3.6 mM | ||
| MgSO4 | 1.8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1.0 mM | ||
| HEPES | 5.0 mM | ||
| High KCL Reptilian Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 86 mM | ||
| KCl | 60 mM | ||
| CaCl2 | 3.6 mM | ||
| MgSO4 | 1.8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1.0 mM | ||
| HEPES | 5.0 mM | ||
| High Sucrose Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 145 mM | ||
| KCl | 2. 5 mM | ||
| CaCl2 | 3.6 mM | ||
| MgSO4 | 1.8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1.0 mM | ||
| HEPES | 5.0 mM | ||
| Sucrose | 0.5 M (17.1 gm/50 mL) | ||
| Equipment: | |||
| Name | Company | Comments | Comments(website) |
| Axioplan 200 inverted microscope | Carl Zeiss [Thornwood, NY] | www.zeiss.com | |
| N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4mm | Carl Zeiss [Thornwood, NY] | www.zeiss.com | |
| DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher | Sutter instruments [Novato, CA] | 175W Xenon arc lamp | www.sutter.com |
| Lambda 10-2 emission filterwheel switcher | Sutter instruments [Novato, CA] | www.sutter.com | |
| Sensicam CCD camera | Cooke Instruments [Tonawanda, NY] | www.cookecorp.com | |
| Cascade 512 CCD camera | Photometrics [Tucson, AZ] | www.photometrics.com | |
| Imaging dishes- made in-house-11cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins | |||
| Software: | |||
| Name | Company | Comments | Comments(website) |
| Slidebook 5.0 | Intelligent Imaging Innovations [Denver, CO] | Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation | www.intelligent-imaging.com |
| IMARIS 7.5.2 | Bitplane [South Windsor, CT] | Drift correction; 3D and 4D data presentation | www.bitplane.com |
| AfterEffects CS6 | Adobe [San Jose, CA] | Drift correction | www.adobe.com |
| ImageJ 1.46 | National Institutes of Health [Bethesda, MD] | Multiple plugins available;Stereo pair construction | http://rsbweb.nih.gov/ij |
| Zeiss LSM | Carl Zeiss [Thornwood, NY] | Stereo pair construction | www.zeiss.com |
Riferimenti
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy-tips and tools. J. Cell Sci. 122 (6), 753-767 (2009).
- Tinevez, J. -. Y., et al. A quantitative method for measuring phototoxicity of a live cell imaging microscope. Meth. Enzymol. 506, 291-309 (2012).
- Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, (2011).
- Snapp, E. L., Hegde, R. S. Rational design and evaluation of FRETexperiments to measure proteinproximities in cells. Curr. Protoc. Cell Biol. 17, (2006).
- Stewart, R. S., Teng, H., Wilkinson, R. S. Late” macroendosomes and acidic endosomes in vertebrate motor nerve terminals. J. Comp. Neurol. 520, 4275-4293 (2012).
- Teng, H., Lin, M. Y., Wilkinson, R. S. Macroendocytosis and endosome processing in snake motor boutons. J. Physiol. 582, 243-262 (2007).
- McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19, 373-385 (1999).
- Swedlow, J. R., Platani, M. Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution. Cell Struct. Funct. 27, 335-341 (2002).
- Cromey, D. W., Taatjes, D. J., Roth, J. Digital images are data: and should be treated as such. Methods Mol. Biol. 931, 1-27 (2013).
- Teng, H., Wilkinson, R. S. Clathrin-mediated endocytosis near active zones in snake motor terminals. J. Neurosci. 20 (21), 7986-7993 (2000).
- Teng, H., Cole, J. C., Roberts, R. L., Wilkinson, R. S. Endocytic active zones: hot spots for endocytosis in vertebrate nerve terminals. J. Neurosci. 19 (12), 4855-4866 (1999).
- Tan, T. T. T., Khaw, C., Ng, M. M. L., Mendez-Vilas, A., Diaz, J. Challenges and recent advances in live cell bioimaging. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. , 1495-1505 (2010).
- Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. Imaging C. elegans embryos using an epifluorescent microscope and open source software. J. Vis. Exp. (49), (2011).
