네 차원 형광 이미징과 신경 말단 생활에 엔도 좀 역학의 시각화
Summary
사차원 (4D) 영상은 척추 신경 터미널을 살고있는 엔도 좀의 두 가지 유형 사이의 행동과 상호 작용을 연구하기 위해 사용된다. 이 작은 구조의 이동은 같은 엔도 좀의 융합과 세포 외 유출 등의 이벤트의 확인을 허용, 세 가지 차원을 특징으로한다.
Abstract
가터 뱀의 근육을 abdominis 사차원 (4D) 빛의 영상은 얇은 transversus의 모터 신경 터미널에서 작은 구조의 행동을 연구하는 데 사용되었습니다. 원시 데이터는 3D의 Z-스택의 시간 경과 시퀀스를 포함한다. 각 스택은 400-1,500 nm의로 구분 초점 평면에서 표면 형광 광학으로 획득 한 4-20 이미지가 포함되어 있습니다. 이러한 포커스의 조정 등의 화상 스택의 입수 단계는, 여기 파장의 스위칭, 및 디지털 카메라의 동작은, 화상 비율을 최대화하고, 노광에서의 조직 손상을 최소화하기 위해 가능한 한 자동화된다. 인수 후, 이미지 스택의 세트가 공간 해상도를 향상시킬 수 deconvolved되어, 원하는 3D 형식으로 변환하고, 4D "영화"그 노력 실험 데이터에 따라, 컴퓨터 기반 분석의 다양한 적합을 만드는 데 사용됩니다. 하나의 응용 프로그램은 신경 터미널 – macroendosomes에서 발견 엔도 좀의 두 클래스 (MES)의 동적 거동의 연구이다및 (AES) – 누구의 크기 (두 가지 유형 200 ~ 800 nm의) 산성 엔도 좀은 회절 한계에 또는 근처에 있습니다. 각 시점에서의 3D 정보에 대한 액세스는 종래의 시간 경과 이미징에 비해 여러 장점을 제공한다. 특히, 크기 및 구조의 이동 속도는 날카로운 초점의 손실없이 시간을 통해 정량화 할 수있다. 4D 촬상 데이터의 예로는 그들이 exocytosed보다는 단순히 수직 거리에 초점이 하나의 평면에서 이동하는 것을 제안, MES는 원형질막 접근 사라지는 것으로 나타났다. 또한 각 3 직교 전망에서 볼 때 두 염료를 포함하는 구조에 대한 중복 시각화하여 MES 및 AES의 추정 융합입니다 밝혔다.
Introduction
조직 생활의 시간 경과 영상은 시간의 한 지점에서 이미지가 고정 또는 생활 준비에 알 수없는 동적 구조 – 기능 관계에 대한 시각에 대한 액세스를 제공합니다. 그러나, 종종 시간 정보에 액세스하기위한 트레이드 오프는 광학 해상도의 감소이다. 높은 수치 조리개 기름 침지 목표는 유일한 대안으로 침수 또는 건조 목적을두고 있기 때문에 초점이 자신의 좁은 범위의 조직 생활에 실용적이다. 또한, 공 초점 광학에 의해 제공 증가 된 해상도는 조명의 상대적으로 높은 수준의 1,2 필요한에서 광독성 환경에 따라 약간의 생활 준비에 활용 될 수 없습니다. 여러 실시간 또는 시간 경과 광학 기술이 제공하는 향상된 해상도를 사용할 수있는 동안 마지막으로, 자신의 적용은 그 구조가 목표 1의 몇 백 나노 미터 내에 위치 할 수있는 준비로 제한됩니다. 기재된 방법상대적으로 저가의 장비를 사용한다 다목적, 아직 더 일반적으로 사용되는 시간 경과 기술에 비해 향상된 해상도를 제공합니다. 그것은 개인의 실험실뿐만 아니라 영상 시설에서 사용하기위한 것입니다.
방법은 민감한 디지털 카메라로 급속 약간 다른 초점 평면 (Z-스택)에서의 이미지 세트를 획득하기 위해 설계된 하드웨어와 함께, 종래의 표면 형광 현미경을 이용한다. 각각의 Z-스택은 디지털 해상도를 증가 deconvolved된다. 3D 시간 경과 (4D) 영상의 하나의 기능은 세포 기관 또는 다른 구조물을 이동의 정확한 추적합니다. 제대로 설정하면, 몇 군데 구조는 초점이 이동하지 않고, 세 방향으로의 움직임을 관찰하고 정량화 할 수있다. 스테인드 구조는 단지 좁은 초점 평면 위 또는 아래에 표류하여 하나 이상의 시간 경과 프레임에 사라에 따라서는 불가능하다. 방법은 또한 상호 작용 가능한 푸을 평가하기위한 중요한 툴로서 기능작은 구조의 시온. 기존의 표면 형광 또는 회절 한계 (수백 nm의)에 가까운 구조의 공 촛점 이미지가 병합 된 이미지는 각각의 라벨 3의 중복을 보이고도 융합을 확인하지 않습니다. 융합 제안하지만 개체 회절 한계 이하의 거리에 의해 수평 또는 수직으로 분리되어 남아있을 수있다. 3-4 차원 화상은, 대조적으로, 세 개의 직교하는 방향의 각각에 오브젝트를 볼 수있게. 모두 세 가지보기에서 융합의 모양은 확실성 수준을 증가시킨다. 그리고, 약간의 생활 준비에, 감독 또는 둘 모두 라벨이 시간에 함께 이동할 때 상상 속으로 융합 개체의 브라운 운동은 더 증거를 제공한다. 물론 때 회절 한계 근처에서 배경 엄선한 구조의 확실성 또는 그들이이 염료 (융합)가 포함되어 있음을 보여주는 수준은 절대 아니다. 만약 예컨대 형광 공명 에너지 전달 (FRET)와 같은 적용, 특수 기술4, 더 적합합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
4D 영상의 가장 중요한 측면은 노광의 지속 시간 및 강도의 관리이다. 광표백은 화상 신호 대 잡음비를 감소 및 형광체의 선택을 포함하는 다양한 요인에 따라 문제 여부 일 수있다. 생체 조직 (광독성)에 비특이적 손상 photobleaching에 관련되어, 때로는 목적 2,12 나 미분 간섭 대비 (DIC)로서 적합한 시야 광학계와 형태의 시험에 의해 설계 형광 프로브를 이용하여 식별 될 수있다.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 건강 그랜트 NS-024572 (RSW에)의 미국 국립 연구소에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents: | |||
| SGC5 | Biotium [Hayward, CA] | 70057 | Final conc:10 mM |
| FM1-43FX | Invitrogen [Carlsbad, CA] | F35335 | Final conc:7 mM |
| LysoTracker Red | Invitrogen [Carlsbad, CA] | L7528 | Final conc:0.2 mM |
| Solutions: | |||
| Reptilian Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 145 mM | ||
| KCl | 2.5 mM | ||
| CaCl2 | 3.6 mM | ||
| MgSO4 | 1.8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1.0 mM | ||
| HEPES | 5.0 mM | ||
| High KCL Reptilian Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 86 mM | ||
| KCl | 60 mM | ||
| CaCl2 | 3.6 mM | ||
| MgSO4 | 1.8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1.0 mM | ||
| HEPES | 5.0 mM | ||
| High Sucrose Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 145 mM | ||
| KCl | 2. 5 mM | ||
| CaCl2 | 3.6 mM | ||
| MgSO4 | 1.8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1.0 mM | ||
| HEPES | 5.0 mM | ||
| Sucrose | 0.5 M (17.1 gm/50 mL) | ||
| Equipment: | |||
| Name | Company | Comments | Comments(website) |
| Axioplan 200 inverted microscope | Carl Zeiss [Thornwood, NY] | www.zeiss.com | |
| N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4mm | Carl Zeiss [Thornwood, NY] | www.zeiss.com | |
| DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher | Sutter instruments [Novato, CA] | 175W Xenon arc lamp | www.sutter.com |
| Lambda 10-2 emission filterwheel switcher | Sutter instruments [Novato, CA] | www.sutter.com | |
| Sensicam CCD camera | Cooke Instruments [Tonawanda, NY] | www.cookecorp.com | |
| Cascade 512 CCD camera | Photometrics [Tucson, AZ] | www.photometrics.com | |
| Imaging dishes- made in-house-11cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins | |||
| Software: | |||
| Name | Company | Comments | Comments(website) |
| Slidebook 5.0 | Intelligent Imaging Innovations [Denver, CO] | Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation | www.intelligent-imaging.com |
| IMARIS 7.5.2 | Bitplane [South Windsor, CT] | Drift correction; 3D and 4D data presentation | www.bitplane.com |
| AfterEffects CS6 | Adobe [San Jose, CA] | Drift correction | www.adobe.com |
| ImageJ 1.46 | National Institutes of Health [Bethesda, MD] | Multiple plugins available;Stereo pair construction | http://rsbweb.nih.gov/ij |
| Zeiss LSM | Carl Zeiss [Thornwood, NY] | Stereo pair construction | www.zeiss.com |
Riferimenti
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