Un test Engulfment: un protocollo per valutare le interazioni tra sistema nervoso centrale fagociti e neuroni
Summary
Microglia sono le cellule immunitarie residenti del sistema nervoso centrale (CNS) con una elevata capacità di fagocitare o fagocitare materiale nel loro ambiente extracellulare. Qui, un saggio largamente applicabile, affidabile e altamente quantitativa per la visualizzazione e la misurazione microglia-mediata fagocitazione dei componenti sinaptiche è descritto.
Abstract
La fagocitosi è un processo in cui una cellula avvolge materiale (intera cella, parti di una cellula, detriti, ecc) nel suo ambiente extracellulare circostante e successivamente digerisce questo materiale, comunemente mediante degradazione lisosomiale. Microglia sono le cellule immunitarie residenti del sistema nervoso centrale (CNS) la cui funzione fagocitica è stata descritta in una vasta gamma di condizioni di malattia neurodegenerativa (es. pallone beta-amiloide nella malattia di Alzheimer) allo sviluppo del cervello sano (ad esempio, sinaptica potature) 1-6. Il protocollo che segue è un test fagocitazione sviluppato per visualizzare e quantificare microglia-mediata fagocitazione degli ingressi presinaptici nel sistema retinogeniculate topo in via di sviluppo 7. Mentre questo test è stato utilizzato per valutare la funzione microglia in questo particolare contesto, un approccio simile può essere utilizzato per valutare altri fagociti tutto il cervello (ad esempio, astrociti) e il resto del corpo(ad esempio, macrofagi periferici) nonché altri contesti in cui avviene il rimodellamento sinaptico (ad esempio, il trauma cranico / malattia).
Introduction
Circuiti sinaptici rimodellare tutta la vita di un animale. Nel cervello in via di sviluppo, le sinapsi si formano in eccesso e devono subire la potatura sinaptica che comporta la rimozione selettiva di un sottoinsieme di sinapsi e la manutenzione e il potenziamento di quelle sinapsi che rimangono 8-10. Questo processo è necessario per conseguire la connettività precisa caratteristica del sistema nervoso adulto. Nell'adulto, sinapsi possono anche essere di plastica, in particolare nel contesto di apprendimento e memoria. Le correlazioni strutturali di questa plasticità si pensa di includere l'aggiunta e / o l'eliminazione delle spine dendritiche e boutons presinaptici 11-13. Oltre a questi ruoli nel sistema nervoso sano, rimodellamento sinaptico è anche coinvolto nella nervoso 12,14,15 malattia del sistema / infortunio. Ad esempio, a seguito di lesioni del midollo spinale, gli assoni mozzate successivamente devono rimodellare e formare nuove sinapsi per raggiungere funzionale 16-19 recupero.
nt "> Emergendo come un aspetto importante della plasticità sinaptica è il processo di fagocitosi o fagocitazione delle sinapsi destinati per la rimozione 3,5,20. Abbiamo recentemente dimostrato questo fenomeno nel contesto della potatura sinaptica nel sano, postnatale cervello di topo 7. particolare , microglia, i residenti del SNC cellule immunitarie e fagociti, sono stati mostrati per inghiottire ingressi presinaptici nel corso di un periodo di picco e in una regione di sviluppo di potatura sinaptica, la postnatale dorsale nucleo genicolato laterale (dLGN) del talamo. blocco genetica o farmacologica di questa fagocitazione portato a disavanzi sostenuti nella connettività sinaptica.In questo protocollo, si descrive un test affidabile e altamente quantitativo per misurare fagociti-mediata fagocitazione degli ingressi presinaptici. Ai fini del presente articolo, questo saggio sarà presentato nel contesto del sistema di sviluppo retinogeniculate, che comprende le cellule gangliari retiniche (RGC) residenti nella retina cheproiettare ingressi presinaptici al dLGN (Figura 1A). Per iniziare, un anterograda strategia etichettatura degradazione resistente lisosomiale sarà descritto, che viene utilizzato per visualizzare RGC-specifici ingressi presinaptici nel dLGN (Figura 1) 7,21. A seguito di questa descrizione, una metodologia dettagliata per l'imaging e misurare quantitativamente fagocitazione usando la microscopia confocale in combinazione con 3 dimensioni (3D) della superficie volume rendering sarà dato. Questa metodologia si basa sulla preparazione del tessuto fisso, ma può anche essere adattato per l'utilizzo in studi di imaging dal vivo. È importante sottolineare che, mentre il test è stato convalidato nel contesto del sistema retinogeniculate sano, postnatale, si potrebbe applicare le stesse tecniche per valutare altre interazioni fagociti neuroni in tutto il cervello e durante la malattia, così come la funzione dei fagociti in altri organi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Al fine di misurare con precisione la fagocitosi, materiale inghiottito deve essere etichettato in modo tale che il ricercatore può visualizzare una volta è verificato degradazione lisosomiale. Inoltre, è necessaria imaging ad alta risoluzione, seguito dall'uso di software che permetterà al ricercatore di visualizzare il volume dell'intera cella e quantificare il contenuto. In questo protocollo, si descrive un metodo altamente affidabile e quantitativo per la misurazione fagocitazione phagocyte-mediata con C…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro è stato sostenuto da finanziamenti della Fondazione Famiglia Smith (BS), Dana Foundation (BS), John Merck Scholars Program (BS), NINDS (RO1-NS-07100801, BS), NRSA (F32-NS-066698; DPS), Nancy Lurie Marks Foundation (DPS), NIH (P30-HD-18655; MRDDRC Imaging Core).
Materials
| Heat pad | Vet Equip, Inc. | 965500 | |
| Warm water source for heat pad | Kent Scientific | TP-700 | |
| Stereo microscope | DSC Optical | Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope | |
| Sliding microtome with freezing stage | Leica | SM2010 R | |
| Microtome blade | Leica | 14021607100 | |
| Fluorescent dissecting microscope | Nikon | SMZ800 with Epi-fluorescence attachment | |
| Spinning disk confocal microscope | Perkin Elmer | UltraView Vox Spinning Disk Confocal | |
| 10 µl Hamilton gas tight syringes | Hamilton | 80030 | Use a different syringe for each color dye/tracer |
| Hamilton needles | Hamilton | 7803-05, specifications: blunt, 1.5" | |
| Alexa-conjugated cholera toxin β subunit (CTB) | Invitrogen | 488: C22841 | Reconstitute in sterile saline, 80 µl (488), 100 µl (594), 20 µl (647) |
| 594: C22842 | |||
| 647: C34778 | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P4417-50TAB | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment) | Bausch & Lomb | 24208-780-55 | |
| 30.5 gauge needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5630 | |
| Cotton-tipped applicator | Fisher | 23-400-125 | |
| Paraformaldeyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute 16%to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use in a fume hood and wear personal protective equipment. |
| Dissection tools – scissors, forceps, spatula | Small scissors: Fine Science Tools | Small scissors:14370-22 | |
| Large scissors: Roboz | Large scissors: RS-6820 | ||
| #55 forceps: Fine Science Tools | #55 forceps: 11255-20 | ||
| Spatula: Ted Pella, Inc. | Spatula: 13504 | ||
| Sucrose | Sigma | S8501-5KG | Make 30% sucrose in PBS (weight/vol) |
| OCT Compound | VWR | 25608-930 | |
| Weigh boat | USA Scientific | 2347-1426 | |
| 24-well plates | BD Biosciences | 353047 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S6566-500G | Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH20 and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH20. To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH20 |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136-500G | |
| Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5 | VWR | 48393 194 | |
| Charged microscope slide | VWR | 48311-703 | |
| Vectasheild | Vector Laboratories | H-1200 |
Riferimenti
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