말림 분석 : CNS 식세포와 신경 세포 사이의 상호 작용을 평가하기위한 프로토콜
Summary
미세 아교 세포는 세포 외 환경에서 소재를 탐식거나 삼키는 고용량으로 중추 신경계 (CNS)의 상주 면역 세포이다. 여기 시냅스 구성 요소의 미세 아교 세포 – 매개 말림을 시각화 및 측정 광범위하게 적용, 신뢰성, 높은 정량 분석은 설명한다.
Abstract
식균 작용은 세포가 주변 세포 환경에서 자료 (전체 세포, 세포, 이물질 등의 일부를) 침몰 이후에 일반적으로 리소좀의 분해를 통해이 물질을 소화하는 과정이다. 미세 아교 세포는 식세포 기능 신경 퇴행성 질환 건강한 뇌의 발달 (알츠하이머 병의 예, 베타 – 아밀로이드 클리어런스) (즉, 시냅스에서의 조건의 넓은 범위에 설명 된 중추 신경계 (CNS)의 상주 면역 세포 아르 가지 치기) 1-6. 다음 프로토콜 개발 마우스 retinogeniculate 체제 7 연접 입력 미세 아교 세포 – 매개 말림을 시각화하고 계량화하기 위해 개발 말림 분석법이다. 이 분석은 특정 컨텍스트에서 미세 아교 세포의 기능을 평가하기 위해 사용되었지만, 유사한 접근법은 뇌 (예를 들어, 성상 교세포) 및 신체의 나머지 다른 식세포를 평가하기 위해 사용될 수있다(예를 들어, 말초 식세포)뿐만 아니라 시냅스 리모델링이 발생하는 다른 문맥 (예, 뇌 손상 / 질병).
Introduction
시냅스 회로는 동물의 생활 전반에 걸쳐 리모델링. 개발 두뇌에서 시냅스가 초과 형성하고 시냅스의 일부를 선택적으로 제거 및 8-10 유지하는 시냅스의 유지 및 강화를 포함 시냅스 가지 치기를 받아야한다. 이 프로세스는 성인 신경계의 정확한 연결 특성을 달성 할 필요가있다. 성인에서, 시냅스 또한 특히 학습 및 기억의 맥락에서 플라스틱 일 수있다. 이 가소성의 구조적 상관 관계가 돌기 쪽과 연접 BOUTONS 11 ~ 13의 추가 및 / 또는 제거를 포함하는 것으로 생각된다. 건강한 신경 시스템의 이러한 역할뿐만 아니라, 시냅스 리모델링은 신경계 질병 / 상해 12,14,15에 참여하고있다. 예를 들면, 척수 손상 후, 절단 축삭이어서 개조 및 기능적 회복 16-19을 달성하기 위해 새로운의 시냅스를 형성한다.
NT는 "> 시냅스 가소성의 중요한 부분으로 신흥 식균 작용 또는 제거 3,5,20 향하는 시냅스의 말림하는 과정입니다. 우리는 최근 건강, 출생 후 마우스의 뇌 7 시냅스 가지 치기의 맥락에서이 현상을 보였다. 특히 , 미세 아교 세포는 상주 CNS 면역 세포와 대 식세포는 피크 기간 동안 발달 시냅스 가지 치기, 시상의 출생 등의 측면 굽은 핵 (dLGN)의 영역에서 시냅스 입력을 삼켜 표시했다.이 말림의 유전자 또는 약물 봉쇄 시냅스 연결의 지속적인 적자로 만들었습니다.이 프로토콜에서는, 우리는 시냅스 입력 식세포 매개 말림을 측정하는 신뢰성 높은 정량 분석에 대해 설명합니다. 이 문서의 목적을 위해,이 분석에서는 망막에 존재하는 망막 신경절 세포를 포함 현상 retinogeniculate 시스템 (망막 신경절)의 맥락에서 제시 될 것이라는dLGN (그림 1A)에 시냅스 입력을 전망이다. 시작하기 위해, 리소좀 분해 내성 선행 성 라벨 전략 dLGN에서 RGC 특정 시냅스 입력 (도 1) 7,21를 시각화하는데 사용되는, 설명한다. 이 설명, 이미징을위한 세부 방법론에 따라 정량적으로 3 차원 (3D) 표면의 볼륨 렌더링과 결합 된 공 초점 현미경을 사용하여 말림을 측정하는 받게 될 것입니다. 이 방법론은 고정 티슈 제조에 기반뿐만 아니라 라이브 영상 연구에 사용하기 위해 적응 될 수있다. 분석은 건강한, 출생 후의 retinogeniculate 시스템의 맥락에서 검증되었지만 중요한 하나는 다른 뇌로 걸쳐 질병 중에 식세포 신경 세포의 상호 작용뿐만 아니라 다른 장기 시스템의 식세포 기능을 평가하기 위해 동일한 기술을 적용 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
식균 작용을 정확하게 측정하기 위해, 재료가 잠겼 리소좀 분해가 발생하면 연구자가 그것을 시각화 할 수있는 방식으로 표시하여야한다. 또, 고해상도 영상은 셀 전체의 볼륨을 시각화하고 그 내용을 정량화 연구원있게 소프트웨어의 사용에 선행 요구된다. 이 프로토콜에서는, 우리는 높은 해상도의 공 초점 현미경 및 3D 재건과 함께 가득 채우고 재료 레이블을 알렉사 염료에 접합 CTB를 사용하?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
,,, NRSA (DPS F32-NS-066698) 작업은 스미스 가족 재단 (BS), 다나 재단 (BS), 존 머크 학자 프로그램 (BS), NINDS (BS RO1-NS-07100801)에서 교부금에 의해 지원되었다 낸시 루리 마크 재단 (DPS), NIH (P30-HD-18655; MRDDRC 이미징 코어).
Materials
| Heat pad | Vet Equip, Inc. | 965500 | |
| Warm water source for heat pad | Kent Scientific | TP-700 | |
| Stereo microscope | DSC Optical | Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope | |
| Sliding microtome with freezing stage | Leica | SM2010 R | |
| Microtome blade | Leica | 14021607100 | |
| Fluorescent dissecting microscope | Nikon | SMZ800 with Epi-fluorescence attachment | |
| Spinning disk confocal microscope | Perkin Elmer | UltraView Vox Spinning Disk Confocal | |
| 10 µl Hamilton gas tight syringes | Hamilton | 80030 | Use a different syringe for each color dye/tracer |
| Hamilton needles | Hamilton | 7803-05, specifications: blunt, 1.5" | |
| Alexa-conjugated cholera toxin β subunit (CTB) | Invitrogen | 488: C22841 | Reconstitute in sterile saline, 80 µl (488), 100 µl (594), 20 µl (647) |
| 594: C22842 | |||
| 647: C34778 | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P4417-50TAB | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment) | Bausch & Lomb | 24208-780-55 | |
| 30.5 gauge needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5630 | |
| Cotton-tipped applicator | Fisher | 23-400-125 | |
| Paraformaldeyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute 16%to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use in a fume hood and wear personal protective equipment. |
| Dissection tools – scissors, forceps, spatula | Small scissors: Fine Science Tools | Small scissors:14370-22 | |
| Large scissors: Roboz | Large scissors: RS-6820 | ||
| #55 forceps: Fine Science Tools | #55 forceps: 11255-20 | ||
| Spatula: Ted Pella, Inc. | Spatula: 13504 | ||
| Sucrose | Sigma | S8501-5KG | Make 30% sucrose in PBS (weight/vol) |
| OCT Compound | VWR | 25608-930 | |
| Weigh boat | USA Scientific | 2347-1426 | |
| 24-well plates | BD Biosciences | 353047 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S6566-500G | Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH20 and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH20. To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH20 |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136-500G | |
| Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5 | VWR | 48393 194 | |
| Charged microscope slide | VWR | 48311-703 | |
| Vectasheild | Vector Laboratories | H-1200 |
Riferimenti
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