במבחני צבירת מבחנה באמצעות חלבון Hyperphosphorylated טאו
Summary
חלבוני טאו ללא שינוי וhyperphosphorylated שמשו בשני מבחני צבירה במבחנה כדי לחשוף את קינטיקה הצבירה מהירה hyperphosphorylation תלוי. מבחני אלה יסללו את הדרך למסכים בעתיד לתרכובות שיכולות להשפיע על הנטייה של טאו hyperphosphorylated כדי ליצור סיבים העומדים בבסיס ההתקדמות של מחלת אלצהיימר.
Abstract
Alzheimer’s disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer’s disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.
Introduction
מחלת אלצהיימר (AD) היא אחד מאוסף גדול של הפרעות ניווניות הידועות כtauopathies. Tauopathy פתולוגיה שבבסיס המובהק הוא סבכי neurofibrillary, NFTS, בתאי עצב, האסטרוציטים ומיקרוגליה 1-4. צפיפות NFT האזור בקורלציה עם ליקוי קוגנטיבי 3.5 ונוירון הפסד 6. NFT האזור מכיל חלבון בעיקר hyperphosphorylated טאו (המכונה "p-טאו" מעתה ואילך) שיוצר חוטים ישרים או לזווג סליל (PHF) 7,8. טאו הוא חלבון הקשורים microtubule חשב כדי להקל על תחבורת axonal שהיא חיוני לאיתות וסחר 9,10 עצביות. כל מולקולת טאו מכילה 2 עד 3 פוספטים במוח נורמלי, אבל עליות תוכן phosphoryl על ידי כמה קפלים בחולי tauopathy 11. קינאז מרובים עשוי לתרום לhyperphosphorylation טאו כולל GSK3β (3β kinase synthase גליקוגן) וCDK5 (cyclin-dekinase התליון 5) 12,13, אבל ההדק הישיר לזירחון פתולוגי נשאר 14 חמקמקים. זירחון החריג בתוך או ליד המוטיבים מחייב microtubule dissociates טאו מmicrotubule 15, וגורם לטאו אי-לוקליזציה לתא somatodendritic, שבו p-טאו oligomerizes לחוטי סליל ישרים או לזווג שיכול בסופו פלמר לתכלילים NFT אזור. הקשר ההדוק בין hyperphosphorylation טאו, היווצרות NFT אזור, וניוון של מערכת עצבים הוביל להשערה הרווחת כי סבכי p-טאו לעורר תגובה ציטוטוקסיות אפופטוטיים ואחרת, ובכך הוא הגורם הבסיסי לניוון של מערכת עצבי tauopathy 16,17. מסכי סמים ובדיקות קליניות מוקדמות המבוססים על הנחה זו כבר הושקו 18. עם זאת, השערה זו עומדת בפני אתגרים 19,20. לדוגמא, Santacruz et al. הראה כי תפקודים קוגניטיביים של עכברים הטרנסגניים ניתן לשפר על ידי דיכוי הביטוי של מוטציהטאו האנושי, למרות שNFTS המשיך ליצור ממולקולות טאו קיימות 21. במודל דרוזופילה, NFT אזור הוצגו לעקל טאו cytosolic הרעיל כדי להגן על תאי עצב שבבסיס 22,23. ברור, את התפקיד בפתוגנזה של NFT אזור, אם בכלל, ישפיע באופן משמעותי את הכיוון של פיתוח תרופות tauopathy.
בריכוזים גבוהים, חלבון tau המוח רקומביננטי או נורמלי באופן ספונטני אבל לאט לאט polymerizes למבנה כמו PHF-במבחנה, כפי שצוין על ידי הקשירה של כמה צבעי β גיליון העדיפו ניאון, במיקרוסקופ אלקטרונים, וספקטרוסקופיה פיזור אור 24-27. הפרין הוספה או חומצה הארכידונית, חומצת שומן בשפע במוח אנושי, באופן דרסטי מאיצה היווצרות PHF בisoform- טאו ונימוסי ריכוז תלוי inducer 28-32. מעניין לציין, שטאו hyperphosphorylated מטוהר ממוח לספירה או שהוכן על ידי ממצה בתגובות זירחון מבחנהggregates מהיר ויעיל יותר 26,33-35. תוצאות אלו הן בהסכם מצוין עם התפקידים פתולוגית של p-טאו. מערכת במבחנה המבוססת על הצבירה של p-טאו ניתן אפוא לשמש ככלי רב עוצמה להקרנת סמים לספירה.
לאור קשר ההדוק בין צבירת טאו והניוון של מערכת העצבים ההדרגתית של הספירה, כמו גם הכישלון האחרון בפיתוח תרופות מיקוד פלאק Aβ, עוד סמן היסטולוגית מפתח של הספירה 36-38, העניין בגילוי תרופות השולטות צבירת טאו עולה. ואכן, כמה קבוצות כבר החלו מסכי סמים בתפוקה שונה, תוך שימוש בתגובות צבירת טאו מבחנה, כמו assay העיקרי. מספר הכימיקלים נמצא להציג פעילויות מעכבות או היפוך על הצטברות טאו במבחנה 39-42. עם זאת, כל מסכים רגולטור צבירת טאו טאו הנוכחי להשתמש ללא שינוי שמחטיא את מטרת פתולוגי המפתח של זרחןylation, העלאת דאגה לייחודו ויעילותו של שימוש בתרכובות אלו בטיפול לספירה.
אחד המכשולים העיקריים של פיתוח מבחני קיבוץ לאפיון ביוכימי והקרנת הסמים AD הוא הייצור של כמויות מספיקות של חלבון טאו hyperphosphorylated הרלוונטי pathophysiologically. שימוש במערכת קטליזה-Assisted הרוכסנים שבי איזופורם 1N4R של טאו וkinase GSK-3β הם שיתוף לידי ביטוי בE. coli כחלבוני היתוך רוכסן לאוצין, יש לנו להתגבר על האתגר הזה (. סוי et al, הוגש; ראה איור 1 עבור המוצרים הסופיים של טאו וp-טאו; ראה גם 43 לאפיון ספקטרומטריית מסה ראשוני של p-טאו). מהרכב של תשעה נוגדנים ספציפיים לאתרי זירחון שונים של טאו, אותות חיוביים נראו בשמונה עמדות (מידע לא מוצג). בהמשך, אנו מתארים פרוטוקולים וinstrumentations שיכול להבדיל ד הקינטית הצבירהifferences בין טאו ללא שינוי ומיני p-טאו. מבחני אלה שונה מפרוטוקולים שפורסמו שנמדדו העלייה של הקרינה של thioflavin T (THT) או thioflavin S (THS) על עמילואיד (מצרפי טאו) מחייב 26. ב" המסוף "הראשון, גישה לא-צבע, תגובות צבירה הם התאספו וטופחו בהעדר צבע עמילואיד. בנקודות זמן שונות, aliquot של כל תגובה מוסרת ומעורבב עם נפח שווה של חיץ tht המכיל לעצור צבירה ולאפשר tht להיקשר אגרגטים טאו. הקרינה נמדדת על ידי fluorometer IAP FluoroMax-2. במקרה השני "עם צבעים" assay מעקב הרציף, THT או THS כלול בתגובות הצבירה. הקרינה ניתן למדוד באופן רציף לאורך כל הניסוי באופן ידני או באמצעות קורא רב-צלחת. בנוסף, אנו מתארים assay המשתמש בריכוז ליד-פיסיולוגי של טאו וp-טאו לקיבוץ במו המדידה המתמשךדה. ההשפעה של זירחון נשארה לזיהוי בקלות. להלן, נתאר נהלי פעולת צעד-אחר-צעד, ולהראות תוצאות נציג של מבחני אלה. דיון בכמה מהיתרונות והחסרונות של כל גישה, כמו גם יישומי הקרנת סמים פוטנציאליים יבוא בעקבותיו.
בריכוז גבוה, טאו אגרגטים למבנים דמויים-עמילואיד באופן ספונטני. עם זאת, במעבדה, fibrillization טאו מואץ בדרך כלל על ידי מעוררים כגון הפרין (משקל מולקולרי ממוצע, 6,000 g / mol) וחומצה הארכידונית. דוגמאות שמוצגים במסמך זה כוללים 30 מיקרומטר הפרין. ההיווצרות של אגרגטים עמילואיד טאו מנוטרת על ידי הקרינה הנובעת מעמילואיד הכריכה בthioflavin T (THT) או thioflavin S (THS). על כריכה למצרפי טאו, THT מציג משמרת אדומה בקרינה (עירור: 450 nm; פליטת שיא: 485 ננומטר). THS, לעומת זאת, יש פליטה חלשה ב 510 ננומטר (עירור ב 450 ננומטר) לפני עמילואיד מחייב, אבל fluorescenc זהעליות דואר באופן משמעותי בנוכחות של חלבון עמילואיד כגון טאו מצטבר 44. שני הצבעים לעבוד גם באיתור צבירת טאו וp-טאו. בגלל שיא הפליטה החזק ורחב יחסית של tht (ראה איור 2), יש הפחתת% רק 30 ביחידת הקרינה ב 510 ננומטר. לנוחיותכם, אנו משתמשים באותו שילוב של אורכי גל עירור / פליטה (כלומר, 450 nm / 510 ננומטר) כדי לפקח על צבירת טאו בעת שימוש או צבע.
צבירת טאו ניתן לעשות זאת בנוכחות או עדר של הצבע, בהתאם למטרה של assay ואת הזמינות של חלבון טאו. שני המצבים של תגובות מוצגים להלן. בנוסף, אנו מדגימים את פעולתם של שני מכשירים שונים – fluorometer יחיד מדגם (ISA-SPEX FluoroMax-2) וקורא רב-צלחת (SpectraMax M2). קוראים צריכים להיות מסוגלים להתאים את הפרוטוקולים הללו כדי להתאים לצרכימים הספציפיים שלהם וזמינות מכשיר.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מדגים תנאי assay שונים ומכשירים המזהים קינטיקה צבירת טאו המהיר זירחון תלוי. בassay המסוף, צבע הקרינה tht מתווסף לחלק מהתגובה הוסרה מתערובת האמן בכל נקודת זמן. עמילואיד-induced כריכת הקרינה נמדדה 26 אז. במקרה השני, עם צבעי מצב, צבירת טאו מתבצעת בנוכחות tht או THS, טי…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the National Institute on Aging (AG039768) to MHK. We thank Drs. Thomas Sharkey and Honggao Yan for generously providing the instruments, as well Sean Weise and Yan Wu for technical assistance.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| NaCl | Macron Fine Chemicals | MAL-7581-06 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Invitrogen | 15576-028 | |
| Thioflavin T | Sigma | T3516 | Stored in dark |
| Thioflavin S | Sigma | T1892 | Stored in dark |
| heparin | Sigma | H3393 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9779 | Stored at 4°C |
| 96-well plate | Corning | 3917 | |
| ISA SPEX FluoroMax-2 | Horiba | ||
| SpectraMax M2 Multi-Mode Microlate Reader | Molecular Devices | ||
| Mouse Anti-Tau Monoclonal Antibody | R&D Systems | MAB3494 | Stored at –80° |
Riferimenti
- Lee, V. M., Goedert, M., Trojanowski, J. Q. Neurodegenerative tauopathies. Annu Rev Neurosci. 24, 1121-1159 (2001).
- Ballatore, C., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q. Tau-mediated neurodegeneration in Alzheimer’s disease and related disorders. Nat Rev Neurosci. 8 (9), 663-672 (2007).
- Arriagada, P. V., Marzloff, K., Hyman, B. T. Distribution of Alzheimer-type pathologic changes in nondemented elderly individuals matches the pattern in Alzheimer’s disease. Neurology. 42 (9), 1681-1688 (1992).
- Arriagada, P. V., Growdon, J. H., Hedley-Whyte, E. T., Hyman, B. T. Neurofibrillary tangles but not senile plaques parallel duration and severity of Alzheimer’s disease. Neurology. 42 (3 Pt 1), 631-639 (1992).
- Bancher, C., Braak, H., Fischer, P., Jellinger, K. A. Neuropathological staging of Alzheimer lesions and intellectual status in Alzheimer’s and Parkinson’s disease patients. Neurosci Lett. 162 (1-2), 179-182 (1993).
- Guillozet, A. L., Weintraub, S., Mash, D. C., Mesulam, M. M. Neurofibrillary tangles, amyloid, and memory in aging and mild cognitive impairment. Arch Neurol. 60 (5), 729-736 (2003).
- Hasegawa, M., et al. Protein sequence and mass spectrometric analyses of tau in the Alzheimer’s disease brain. J Biol Chem. 267 (24), 17047-17054 (1992).
- Matsuo, E. S., et al. Biopsy-derived adult human brain tau is phosphorylated at many of the same sites as Alzheimer’s disease paired helical filament tau. Neuron. 13 (4), 989-1002 (1994).
- Bamburg, J. R., Bloom, G. S. Cytoskeletal pathologies of Alzheimer disease. Cell Motil Cytoskeleton. 66 (8), 635-649 (2009).
- Denk, F., Wade-Martins, R. Knock-out and transgenic mouse models of tauopathies. Neurobiol Aging. 30 (1), 1-13 (2009).
- Gong, C. X., Iqbal, K. Hyperphosphorylation of microtubule-associated protein tau: a promising therapeutic target for Alzheimer disease. Curr Med Chem. 15 (23), 2321-2328 (2008).
- Mazanetz, M. P., Fischer, P. M. Untangling tau hyperphosphorylation in drug design for neurodegenerative diseases. Nat Rev Drug Discov. 6 (6), 464-479 (2007).
- Brunden, K. R., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Advances in tau-focused drug discovery for Alzheimer’s disease and related tauopathies. Nat Rev Drug Discov. 8 (10), 783-793 (2009).
- Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer’s disease. N Engl J Med. 362 (4), 329-344 (2010).
- Buee, L., Bussiere, T., Buee-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders. Brain Res Brain Res Rev. 33 (1), 95-130 (2000).
- Lee, V. M., Brunden, K. R., Hutton, M., Trojanowski, J. Q. Developing therapeutic approaches to tau, selected kinases, and related neuronal protein targets. Cold Spring Harb Perspect Med. 1 (1), 006437 (2011).
- Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. Biochemistry and cell biology of tau protein in neurofibrillary degeneration. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), a006247 (2012).
- Bulic, B., Pickhardt, M., Mandelkow, E. Progress and Developments in Tau Aggregation Inhibitors for Alzheimer Disease. J Med Chem. 56 (11), 4135-4155 (2013).
- Cowan, C. M., Quraishe, S., Mudher, A. What is the pathological significance of tau oligomers. Biochem Soc Trans. 40 (4), 693-697 (2012).
- Spires-Jones, T. L., Kopeikina, K. J., Koffie, R. M., de Calignon, A., Hyman, B. T. Are tangles as toxic as they look. J Mol Neurosci. 45 (3), 438-444 (2011).
- SantaCruz, K., et al. Tau suppression in a neurodegenerative mouse model improves memory function. Science. 309 (5733), 476-481 (2005).
- Wittmann, C. W., et al. Tauopathy in Drosophila: neurodegeneration without neurofibrillary tangles. Science. 293 (5530), 711-714 (2001).
- Shulman, J. M., Feany, M. B. Genetic modifiers of tauopathy in Drosophila. Genetica. 165 (3), 1233-1242 (2003).
- Wille, H., Drewes, G., Biernat, J., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. Alzheimer-like paired helical filaments and antiparallel dimers formed from microtubule-associated protein tau in vitro. J Cell Biol. 118 (3), 573-584 (1992).
- Alonso, A., Zaidi, T., Novak, M., Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K. Hyperphosphorylation induces self-assembly of tau into tangles of paired helical filaments/straight filaments. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (12), 6923-6928 (2001).
- Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro. Methods Mol Biol. 299, 35-51 (2005).
- Wilson, D. M., Binder, L. I. Polymerization of microtubule-associated protein tau under near-physiological conditions. J Biol Chem. 270 (41), 24306-24314 (1995).
- Wilson, D. M., Binder, L. I. Free fatty acids stimulate the polymerization of tau and amyloid beta peptides. In vitro evidence for a common effector of pathogenesis in Alzheimer’s disease. Am J Pathol. 150 (6), 2181-2195 (1997).
- Perez, M., Valpuesta, J. M., Medina, M., Montejo de Garcini, E., Avila, J. Polymerization of tau into filaments in the presence of heparin: the minimal sequence required for tau-tau interaction. J Neurochem. 67 (3), 1183-1190 (1996).
- Carlson, S. W., et al. A complex mechanism for inducer mediated tau polymerization. Biochimica. 46 (30), 8838-8849 (2007).
- Goedert, M., et al. Assembly of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like filaments induced by sulphated glycosaminoglycans. Nature. 383 (6600), 550-553 (1996).
- King, M. E., Gamblin, T. C., Kuret, J., Binder, L. I. Differential assembly of human tau isoforms in the presence of arachidonic acid. J Neurochem. 74 (4), 1749-1757 (2000).
- Rankin, C. A., Sun, Q., Gamblin, T. C. Pseudo-phosphorylation of tau at Ser202 and Thr205 affects tau filament formation. Brain Res Mol Brain Res. 138 (1), 84-93 (2005).
- Rankin, C. A., Sun, Q., Gamblin, T. C. Pre-assembled tau filaments phosphorylated by GSK-3b form large tangle-like structures. Neurobiol Dis. 31 (3), 368-377 (2008).
- Grundke-Iqbal, I., et al. Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau (tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (13), 4913-4917 (1986).
- Castellani, R. J., Perry, G. Pathogenesis and disease-modifying therapy in Alzheimer’s disease: the flat line of progress. Arch Med Res. 43 (8), 694-698 (2012).
- Green, R. C., et al. Effect of tarenflurbil on cognitive decline and activities of daily living in patients with mild Alzheimer disease: a randomized controlled trial. JAMA. 302 (23), 2557-2564 (2009).
- Gauthier, S., et al. Effect of tramiprosate in patients with mild-to-moderate Alzheimer’s disease: exploratory analyses of the MRI sub-group of the Alphase study. J Nutr Health Aging. 13 (6), 550-557 (2009).
- Pickhardt, M., et al. Anthraquinones inhibit tau aggregation and dissolve Alzheimer’s paired helical filaments in vitro and in cells. J Biol Chem. 280 (5), 3628-3635 (2005).
- Crowe, A., Ballatore, C., Hyde, E., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. High throughput screening for small molecule inhibitors of heparin-induced tau fibril formation. Biochem Biophys Res Commun. 358 (1), 1-6 (2007).
- Taniguchi, S., et al. Inhibition of heparin-induced tau filament formation by phenothiazines, polyphenols, and porphyrins. J Biol Chem. 280 (9), 7614-7623 (2005).
- Sigurdsson, E. M. Tau-focused immunotherapy for Alzheimer’s disease and related tauopathies. Curr Alzheimer Res. 6 (5), 446-450 (2009).
- Tan, Y. J., et al. Phosphopeptide Enrichment with TiO-Modified Membranes and Investigation of Tau Protein Phosphorylation. Anal Chem. 85 (12), 5699-5706 (2013).
- Santa-Maria, I., Perez, M., Hernandez, F., Avila, J., Moreno, F. J. Characteristics of the binding of thioflavin S to tau paired helical filaments. J Alzheimers Dis. 9 (3), 279-285 (2006).
- Lira-De Leon, K. I., et al. Molecular mechanism of tau aggregation induced by anionic and cationic dyes. J Alzheimers Dis. 35 (2), 319-334 (2013).
- DiNitto, J. P., Wang, L., Wu, J. C. Continuous fluorescence-based method for assessing dicer cleavage efficiency reveals 3′ overhang nucleotide preference. BioTechniques. 48, 303-311 (2010).
- Maeda, S., et al. Granular tau oligomers as intermediates of tau filaments. Biochimica. 46 (12), 3856-3861 (2007).
- Pickhardt, M., et al. Phenylthiazolyl-hydrazide and its derivatives are potent inhibitors of tau aggregation and toxicity in vitro and in cells. Biochimica. 46 (35), 10016-10023 (2007).
- Rankin, C. A., Sun, Q., Gamblin, T. C. Tau phosphorylation by GSK-3beta promotes tangle-like filament morphology. Mol Neurodegener. 2, 12 (2007).
- McKee, A. C., et al. Chronic traumatic encephalopathy in athletes: progressive tauopathy after repetitive head injury. J Neuropathol Exp Neurol. 68 (7), 709-735 (2009).
- Herrup, K. Reimagining Alzheimer’s disease–an age-based hypothesis. J Neurosci. 30 (50), 16755-16762 (2010).
- Gavett, B. E., Stern, R. A., McKee, A. C. Chronic traumatic encephalopathy: a potential late effect of sport-related concussive and subconcussive head trauma. Clin Sports Med. 30 (1), 179-188 (2011).
- Tsitsopoulos, P. P., Marklund, N. Amyloid-beta Peptides and Tau Protein as Biomarkers in Cerebrospinal and Interstitial Fluid Following Traumatic Brain Injury: A Review of Experimental and Clinical Studies. Front Neurol. 4, 79 (2013).
