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Biologia

생체 외 분석에서 집계 Hyperphosphorylated 타우 단백질을 사용하여

Published: January 02, 2015
doi:
10.3791/51537
, ,
1Department of Biochemistry and Molecular Biology,Michigan State University

Summary

수정되지 hyperphosphorylated 타우 단백질 과인산 화 – 의존성 응집 빠른 반응 속도를 나타 내기 위해 두 응집 시험 관내 어 세이에 사용 하였다. 상기 분석 방법은 알츠하이머 질환의 진행의 기초를 형성하는 피 브릴 hyperphosphorylated 타우 성향을 변조 할 화합물에 대한 미래의 화면에 대해 방법을 포장.

Abstract

Alzheimer’s disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer’s disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

Introduction

(AD) 알츠하이머 병은 퇴행성 신경 알려진 신경 퇴행성 장애의 큰 컬렉션 중 하나이다. 전형적인 병리 기본 타우 병증은 신경 세포, 성상 세포와 미세 아교 세포 1-4의 신경 섬유 엉킴, NFTS입니다. NFT 밀도는인지 장애 3,5 및 신경 세포의 손실 6와 상관 관계. NFT는 직선 또는 쌍 나선형 필라멘트 (PHF) 7,8를 형성 (이하, "P-타우"이라한다) 주로 hyperphosphorylated 타우 단백질이 포함되어 있습니다. 타우 신경 신호 및 인신 매매 9,10 필수적이다 축삭 수송을 용이하게 생각 미세 소관 관련 단백질이다. 각 타우 분자는 2 ~ 3 정상적인 뇌의 인산염,하지만 타우 병증 환자 (11)의 여러 주름으로 포스 콘텐츠 증가가 포함되어 있습니다. 다중 키나아제는 GSK3β (글리코겐 신타 제 키나제 3β) 및 CDK5 (사이클린 드를 포함 타우 과인산 화에 기여할 가능성이있다늘어진 키나제 5) 12, 13,하지만 병적 인 인산화에 대한 직접 트리거가 어려운 14 남아있다. 또는 미세 소관 결합 모티프 근처 이상 인산화는 미세 소관 (15)에서 타우 해리 및 P 타우 결국 NFT 흠으로 중합 할 수 직선 또는 쌍 나선형 필라멘트에 oligomerizes somatodendritic 구획에 타우 잘못 지역화됩니다. 타우 과인산, NFT 형성 및 신경 퇴행 긴밀한 넥타이 P-타우 엉킴은 세포 사멸 및 기타 세포 독성 반응을 유도하고, 따라서 타우 병증의 신경 퇴행 16, 17에 대한 근본 원인임을 널리 가설되었다. 이 전제 약물 화면과 초기 임상 시험은 (18)을 출시했다. 그러나,이 가설은 (19, 20) 도전에 직면 해있다. 예를 들어,기도 Santacruz 등.이 트랜스 제닉 마우스의인지 기능이 돌연변이의 발현을 억제함으로써 개선 될 수 있음을 보여 주었다NFTS 기존 타우 분자 (21)로부터 계속하여 형성하더라도 인간 타우. 초파리 모델에서 근본적인 NFT는 신경 세포를 보호하기 위해 22, 23, 독성 세포질 타우를 격리시키는 것으로 나타났다. 분명히, NFT의 병인 역할은, 어떤 경우, 크게 타우 병증 치료제 개발의 방향에 영향을 미칠 것이다.

몇몇 β 시트 바람직한 형광 염료, 전자 현미경 및 광 산란 분광법 24-27의 결합으로 나타낸 바와 같이 높은 농도, 재조합 또는 정상 뇌 타우 단백질 자발적하지만 서서히 체외 PHF 형 구조로 중합한다. 추가 헤파린 또는 아라키돈 산, 인간 뇌에서의 풍부한 지방산 대폭 타우 isoform- 및 유도제 농도 의존적으로 28-32 PHF의 형성을 가속화. 흥미롭게도, hyperphosphorylated 타우는 AD 뇌에서 정제 또는 체외 인산화 반응에 철저한으로 제조빠른 ggregates보다 효율적으로 26,33-35. 이러한 결과는 P 타우 병리학 적 역할과 매우 잘 일치하고 있습니다. P 타우의 집계에 따라 체외 시스템은 따라서 AD 약물 검사를위한 강력한 도구로 역할을 할 수있다.

타우 집계 및 AD의 진보적 인 신경 퇴행 간의 밀접한 관계뿐만 아니라 아밀로이드 베타 플라크를 대상으로 신약 개발의 최근 실패, AD 36-38의 또 다른 핵심 조직 학적 마커, 타우 집계가 상승 제어 약물 발견에 대한 관심을 감안할 때. 사실, 여러 그룹은 이미 기본 분석 등 체외 타우 집계 반응에 사용하여, 다른 처리량 약물 화면을 시작했다. 화학 물질의 수는 39-42 관내에서 타우 응집에 억제 또는 역전 활동을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 현재의 모든 타우 집계 레귤레이터 화면 형광체의 주요 병리 마크를 벗어났습니다 수정되지 않은 타우를 사용ylation, AD의 치료에 이러한 화합물을 사용하는 특이성 및 효능에 대한 우려를 제기.

생화학 적 특성화 및 AD 약물 스크리닝 응집 분석법을 개발하는 주요 장애물 중 하나는 중요한 pathophysiologically hyperphosphorylated 타우 단백질의 충분한 양의 제조이다. 타우 1N4R 이성체 및 GSK-3β 키나아제 E.에서 공동 발현되는 지퍼 원조 된 촉매 시스템을 사용하여 대장균은 류신 지퍼 융합 단백질로, 우리는이 도전 극복 (. 수이 등, 제출, 타우와 P 타우의 최종 제품에 대한 그림 1 참조; 또한 P 타우 예비 질량 분석 특성화를 위해 43 참조). 다른 타우 인산화 부위에 대한 특정 항체의 아홉 패널에서 양성 신호가 여덟 위치에서 관찰되었다 (데이타 미기재). 다음, 우리는 통합 운동 D를 차별화 할 수 프로토콜 및 측정 장치를 설명수정되지 않은 타우와 P-타우 종 사이의 ifferences. 이러한 분석은 아밀로이드 (타우 집계)에 따라 thioflavin T (THT) 또는 thioflavin S (THS)의 형광의 증가 (26) 결합을 측정 출판 프로토콜에서 수정되었습니다. 제 "터미널"에서, 무 염색 방법은, 응집 반응은 조립 및 아밀로이드 염료의 부재 하에서 배양 하였다. 상이한 시점에서, 각 반응의 분취 액을 제거하고, 타우 응집체를 바인딩 THT를 응집을 중지하도록 THT – 함유 버퍼의 동량 혼합. 형광은 IAP FluoroMax-2 형광 분석기에 의해 측정된다. "와 염색"두 번째에서 지속적인 모니터링 분석은, THT 또는 THS는 응집 반응에 포함되어 있습니다. 수동 형광 실험 전체에 걸쳐 연속적으로 측정 또는 다중 플레이트 판독기를 사용하여 할 수있다. 또한, 우리는 지속적으로 측정 미주리 집계 타우 및 P 타우 거의 생리적 농도를 사용하는 분석을 설명드. 인산화 효과는 용이하게 검출 가능한 남아있다. 다음, 우리는 단계별 작업 절차를 설명하고 이러한 분석의 대표적인 결과를 보여줍니다. 각 방법의 장단점 일부의 토론뿐만 아니라 잠재적 인 약물 검사 응용 프로그램을 따를 것이다.

고농도, 타우 자발적 아밀로이드 – 유사 구조로 집계. 그러나, 실험실에서, 타우 fibrillization 유도제는 일반적으로 헤파린 (평균 분자량 6,000g / mol) 및 아라키돈 산으로 가속된다. 여기에 기술 된 예는 30 μm의 헤파린을 포함한다. 타우 아밀로이드 응집체의 형성은 thioflavin T (THT) 또는 S (THS) thioflavin 결합 아밀로이드에 의한 형광 모니터링합니다. (:; : 485 nm의 피크 방출 450 nm의 여기) 타우 집계에 결합하면, THT는 형광의 적색 이동을 나타낸다. THS, 다른 한편으로는, 아밀로이드 결합 전의 파장 510 ㎚ (450 nm 파장에서)에서 약한 방출을 가지고 있지만,이 fluorescenc이러한 응집 된 타우 (44)들을 주요 아밀로이드 단백질의 존재하에 예를 커진다. 두 염료는 타우와 P 타우 집계를 감지에서 잘 작동합니다. THT 때문에 (도 2 참조)의 비교적 강한 넓은 발광 피크, 510 nm에서 형광 단위의 30 % 감소가있다. 어느 염료를 사용하는 경우의 편의를 위해, 우리는 타우 응집을 모니터링 여기 / 방출 파장 (즉, 450 nm의 / 510 ㎚)의 동일한 조합을 사용한다.

타우 응집 분석의 목적 및 타우 단백질의 가용성에 따라, 염료의 존재 또는 부재 하에서 수행 될 수있다. 반응의 두 모드는 다음과 같습니다. 단일 샘플 형광 (ISA-SPEX FluoroMax-2) 및 다중 – 플레이트 판독기 (를 SpectraMax M2) – 또한, 우리는 두 개의 다른 기기의 동작을 보여준다. 독자의 특정 요구 및 장비 가용성에 맞게이 프로토콜을 적용 할 수 있어야한다.

Protocol

시약 1. 준비 응집 버퍼 준비 (20 mM 트리스, pH가 7.4, 100 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA). 개월 동안 실온에서 안정을 저장합니다. 사용하기 전에 1 mM 디티 오 트레이 톨 (DTT)을 보충합니다. 주 : HEPES 계 완충액 (10 mM HEPES, pH 7.5, 0.1 mM의 EDTA, 5 mM의 DTT)도 타우 응집 유사한 결과를 생성한다. T thioflavin 0.22 μm의 살균 필터 단위로 S 재고 (집계 완충 용액 3 mM의) 솔루션 및 필터 thioflavin 준비합…

Representative Results

재조합 타우와 P 타우 (그림 1)을 사용하여, 우리는 단백질 집계를 amyloidal 바인딩에 THT와 THS의 강한 형광 방출의 포함 타우를 활용, 타우 및 P 타우 집계의 반응 속도를 비교하는 두 개의 서로 다른 프로토콜을 설립 및 P 타우 (그림 2). 또는 응집 반응에서 형광 염료없이 우린 과인산 (도 3-5)로 타우 응집 일관된 향상을 관찰 하였다. 이 자극은 헤파린 무관 (데이?…

Discussion

이 프로토콜은 상이한 분석 조건으로 의존 인산화 타우 응집 빠른 반응 속도를 감지기구를 보여준다. 단말기 분석에서, 형광 염료 THT는 각 시점에서의 마스터 믹스로부터 제거 반응 부에 첨가된다. 아밀로이드 후 26 형광 측정을 유도 결합된다. 두번째 방법으로 염색 모드 타우 응집은 타우 응집체의 성장을 실시간 자동 평가에 적합한 유형의 반응을 렌더링 또는 THT THS의 존재하에…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the National Institute on Aging (AG039768) to MHK. We thank Drs. Thomas Sharkey and Honggao Yan for generously providing the instruments, as well Sean Weise and Yan Wu for technical assistance.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
Trizma base Sigma T1503
NaCl Macron Fine Chemicals MAL-7581-06
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) Invitrogen 15576-028
Thioflavin T Sigma T3516 Stored in dark
Thioflavin S Sigma T1892 Stored in dark
heparin Sigma H3393
DL-Dithiothreitol (DTT) Sigma D9779 Stored at 4°C
96-well plate Corning 3917
ISA SPEX FluoroMax-2 Horiba
SpectraMax M2 Multi-Mode Microlate Reader Molecular Devices
Mouse Anti-Tau Monoclonal Antibody R&D Systems MAB3494 Stored at –80°
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Citazione di questo articolo
Sui, D., Liu, M., Kuo, M. In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein. J. Vis. Exp. (95), e51537, doi:10.3791/51537 (2015).
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