В пробирке агрегации анализов с помощью гиперфосфорилированного тау-белок
Summary
Использование оригинальной и гиперфосфорилированного белки тау были использованы в двух в пробирке агрегации анализов, чтобы выявить гиперфосфорилирование зависит от быстро агрегации кинетики. Эти анализы проложить путь для будущих экранов для соединений, которые могут модулировать склонность гиперфосфорилированного тау с образованием фибриллы, которые лежат в основе прогрессирования болезни Альцгеймера.
Abstract
Alzheimer’s disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer’s disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.
Introduction
Болезнь Альцгеймера (AD) является одним из большой коллекции нейродегенеративных расстройств, известных как тауопатий. Квинтэссенцией патология, лежащая в основе Таупатия является нейрофибриллярные путать, NFTs, в нейронах, астроциты и микроглии 1-4. NFT плотность коррелирует с когнитивными нарушениями 3,5 и нейронов потери 6. NFT содержит первую очередь гиперфосфорилированного тау-белка (обозначаемого как "P-тау" Отныне), который формирует прямые или парные спиральные нити (Phf) 7,8. Тау ассоциированный с микротрубочками белок думал, чтобы облегчить аксонов транспорт, который имеет важное значение для нейронов сигнализации и торговли 9,10. Каждая молекула тау содержит от 2 до 3 фосфатов в нормальном мозге, но фосфорильные возрастает в несколько складок контента в Таупатия пациентов 11. Несколько киназ, вероятно, внести свой вклад в тау-гиперфосфорилированию в том числе GSK3β (гликоген-синтазы-киназы 3β) и CDK5 (циклин-деКулон-киназы 5) 12,13, но непосредственный спуск для патологического фосфорилирования остается неясным 14. Аномальные фосфорилирование в пределах или вблизи микротрубочек связывания мотивов диссоциирует тау из микротрубочек 15, и вызывает неправильное тау локализацию в somatodendritic отсеке, где р-тау oligomerizes в прямой или спаренных спиральных нитей, которые в конечном итоге может полимеризовать в NFT включений. Тесная связь между тау гиперфосфорилированию, NFT образования и нейродегенеративные привело к преимущественному гипотезы, что р-тау связок вызывают апоптоза и другие цитотоксические реакции, и, таким образом, основной причиной для Таупатия нейродегенерацией 16,17. Экраны наркотиков и ранние клинические тесты, основанные на этой предпосылке были начаты 18. Тем не менее, эта гипотеза сталкивается с проблемами 19,20. Например, SantaCruz и др. Показали, что когнитивные функции трансгенных мышей может быть улучшена за счет подавления экспрессии мутантногочеловек тау, хотя NFTs продолжал формироваться из существующих молекул 21 тау. В модели дрозофилы, NFT было показано, что секвестр токсичных цитозольную тау, чтобы защитить основные нейронные клетки 22,23. Очевидно, что патогенез роль NFT, если таковые имеются, будет в значительной степени влиять на направление развития Таупатия терапии.
В высоких концентрациях, рекомбинантного или нормального белка мозг тау спонтанно, но медленно полимеризуется в PHF-подобную структуру в пробирке, как указано связывания нескольких β-листов предпочтительных флуоресцентных красителей, электронная микроскопия, и рассеяния света спектроскопии 24-27. Добавление гепарина или арахидоновая кислота, в изобилии жирных кислот в мозге человека, резко ускоряет образование PHF в тау-isoform- и индукторы концентрации зависит от манеры 28-32. Интересно, что гиперфосфорилированного тау очищенный от мозга объявление или подготовлен исчерпывающий в пробирке реакций фосфорилированияggregates быстрее и более эффективно 26,33-35. Эти результаты находятся в хорошем согласии с патологической ролью р-тау. Система в пробирке на основе обобщения р-тау таким образом, может служить в качестве мощного инструмента для скрининга AD наркотиков.
Учитывая тесную связь между тау агрегации и прогрессивного нейродегенерацией объявление, а также недавнего провала в разработке лекарств, нацеленную на Ар налет, еще один ключевой гистологический маркер 36-38 н.э., то интерес к обнаружены наркотики, которые контролируют агрегации тау растет. Действительно, несколько групп уже начали экраны наркотиков в разное пропускной способности, используя в пробирке реакций агрегации тау в качестве основного анализа. Количество химических веществ были обнаружены проявлять тормозящее или разворота деятельности на агрегацию тау в пробирке 39-42. Тем не менее, все текущие экраны регулятор агрегации тау использовать неизмененный тау, что упускается самый главный патологический знак фосфораylation, поднимая заботу о специфике и эффективности использования этих соединений в лечении БА.
Одним из основных препятствий развития агрегации анализы для биохимического характеристики и скрининга AD наркотиков производство достаточных количеств патофизиологически соответствующей гиперфосфорилированного тау-белка. Использование катализа системы молнии при содействии, в котором 1N4R изоформы тау и GSK-3β киназы которые ко-экспрессируются в E. палочки, как слитых белков лейцин молнии, мы преодолели эту проблему (. Sui и др, представленный; рис 1 для конечных продуктов тау и р-тау; также см 43 для предварительного масс-спектрометрии характеристики р-тау). Из панели из девяти антител, специфичных для различных сайтов фосфорилирования тау, положительные сигналы были замечены в восемь позиций (данные не показаны). Ниже мы опишем протоколов и контрольно-измерительные приборы, которые могут дифференцироваться агрегации кинетическую Differences между неизмененном тау и р-тау-нейтрино. Эти анализы были изменены из опубликованных протоколов, которые измеряли рост флуоресценции тиофлавина Т (ТНТ) или тиофлавина S (тыс) По амилоидных (тау агрегатов) связывание 26. В первом «терминал», подход не краситель, агрегации реакции собирают и инкубировали в отсутствие амилоидного красителя. В различные моменты времени, аликвоту каждой реакции удаляют и смешивают с равным объемом в ThT-содержащего буфера для остановки агрегации и позволить THT связывать тау агрегатов. Измеряют флуоресценцию с помощью ИФА FluoroMax-2 флуорометре. Во втором "с красителем" постоянное анализ мониторинга, ThT или тыс входит в реакциях агрегации. Флуоресценции может быть измерена непрерывно в течение всего эксперимента вручную или с помощью читателю многодисковой. Кроме того, мы опишем анализ, который использует почти-физиологические концентрации тау и р-тау для агрегации в постоянном измерения месде. Эффект фосфорилирования остается легко обнаружить. Ниже мы опишем шаг за шагом процедуры эксплуатации и показать репрезентативные результаты этих анализов. Обсуждение некоторые плюсы и минусы каждого подхода, а также возможности применения скрининга лекарственных препаратов будет следовать.
При высокой концентрации, тау агрегирует в амилоидных структур, подобных спонтанно. Тем не менее, в лаборатории, тау fibrillization обычно ускоряется таких индукторов, как гепарин (средняя молекулярная масса, 6000 г / моль) и арахидоновой кислоты. Примеры, приведенные здесь, включают 30 мкМ гепарин. Образование амилоидных тау агрегатов контролируется флуоресценции в результате амилоида связывания тиофлавина T (ТНТ) или тиофлавина S (тыс). После связывания с тау агрегатов, ThT демонстрирует красное смещение в флуоресценции (возбуждение: 450 нм; пик излучения: 485 нм). Тыс, а с другой стороны, имеет слабую эмиссию при 510 нм (возбуждение при 450 нм) до амилоида связывания, но это fluorescencе значительно возрастает в присутствии амилоидного белка, такие как агрегированный тау 44. Оба красителя хорошо работать в обнаружении тау и р-тау агрегации. Из-за сильного и относительно широкий пик эмиссии ThT (рисунок 2), есть только 30% снижение в блоке флуоресценции при 510 нм. Для удобства, мы используем ту же самую комбинацию длин волн возбуждения / эмиссии (т.е. 450 нм / 510 нм) для наблюдения агрегацию тау при использовании либо краситель.
Тау агрегации может быть сделано в присутствии или в отсутствие красителя, в зависимости от цели анализа, а также наличие тау-белка. Оба режима реакций представлены ниже. Кроме того, мы демонстрируем работу двух разных инструментов – одноместный образец флуорометр (ISA-SPEX FluoroMax-2) и многодисковой читателю (SpectraMax м2). Читатели должны быть в состоянии адаптировать эти протоколы с учетом их конкретных потребностей и наличия инструмента.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол демонстрирует различные условия анализа и инструменты, которые обнаруживают фосфорилирования зависит от быстро тау агрегации кинетики. В терминальной анализа флуоресценции красителей ThT добавляют к части реакции удаляют из основной смеси в каждый момент времени. Амило…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the National Institute on Aging (AG039768) to MHK. We thank Drs. Thomas Sharkey and Honggao Yan for generously providing the instruments, as well Sean Weise and Yan Wu for technical assistance.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| NaCl | Macron Fine Chemicals | MAL-7581-06 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Invitrogen | 15576-028 | |
| Thioflavin T | Sigma | T3516 | Stored in dark |
| Thioflavin S | Sigma | T1892 | Stored in dark |
| heparin | Sigma | H3393 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9779 | Stored at 4°C |
| 96-well plate | Corning | 3917 | |
| ISA SPEX FluoroMax-2 | Horiba | ||
| SpectraMax M2 Multi-Mode Microlate Reader | Molecular Devices | ||
| Mouse Anti-Tau Monoclonal Antibody | R&D Systems | MAB3494 | Stored at –80° |
Riferimenti
- Lee, V. M., Goedert, M., Trojanowski, J. Q. Neurodegenerative tauopathies. Annu Rev Neurosci. 24, 1121-1159 (2001).
- Ballatore, C., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q. Tau-mediated neurodegeneration in Alzheimer’s disease and related disorders. Nat Rev Neurosci. 8 (9), 663-672 (2007).
- Arriagada, P. V., Marzloff, K., Hyman, B. T. Distribution of Alzheimer-type pathologic changes in nondemented elderly individuals matches the pattern in Alzheimer’s disease. Neurology. 42 (9), 1681-1688 (1992).
- Arriagada, P. V., Growdon, J. H., Hedley-Whyte, E. T., Hyman, B. T. Neurofibrillary tangles but not senile plaques parallel duration and severity of Alzheimer’s disease. Neurology. 42 (3 Pt 1), 631-639 (1992).
- Bancher, C., Braak, H., Fischer, P., Jellinger, K. A. Neuropathological staging of Alzheimer lesions and intellectual status in Alzheimer’s and Parkinson’s disease patients. Neurosci Lett. 162 (1-2), 179-182 (1993).
- Guillozet, A. L., Weintraub, S., Mash, D. C., Mesulam, M. M. Neurofibrillary tangles, amyloid, and memory in aging and mild cognitive impairment. Arch Neurol. 60 (5), 729-736 (2003).
- Hasegawa, M., et al. Protein sequence and mass spectrometric analyses of tau in the Alzheimer’s disease brain. J Biol Chem. 267 (24), 17047-17054 (1992).
- Matsuo, E. S., et al. Biopsy-derived adult human brain tau is phosphorylated at many of the same sites as Alzheimer’s disease paired helical filament tau. Neuron. 13 (4), 989-1002 (1994).
- Bamburg, J. R., Bloom, G. S. Cytoskeletal pathologies of Alzheimer disease. Cell Motil Cytoskeleton. 66 (8), 635-649 (2009).
- Denk, F., Wade-Martins, R. Knock-out and transgenic mouse models of tauopathies. Neurobiol Aging. 30 (1), 1-13 (2009).
- Gong, C. X., Iqbal, K. Hyperphosphorylation of microtubule-associated protein tau: a promising therapeutic target for Alzheimer disease. Curr Med Chem. 15 (23), 2321-2328 (2008).
- Mazanetz, M. P., Fischer, P. M. Untangling tau hyperphosphorylation in drug design for neurodegenerative diseases. Nat Rev Drug Discov. 6 (6), 464-479 (2007).
- Brunden, K. R., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Advances in tau-focused drug discovery for Alzheimer’s disease and related tauopathies. Nat Rev Drug Discov. 8 (10), 783-793 (2009).
- Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer’s disease. N Engl J Med. 362 (4), 329-344 (2010).
- Buee, L., Bussiere, T., Buee-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders. Brain Res Brain Res Rev. 33 (1), 95-130 (2000).
- Lee, V. M., Brunden, K. R., Hutton, M., Trojanowski, J. Q. Developing therapeutic approaches to tau, selected kinases, and related neuronal protein targets. Cold Spring Harb Perspect Med. 1 (1), 006437 (2011).
- Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. Biochemistry and cell biology of tau protein in neurofibrillary degeneration. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), a006247 (2012).
- Bulic, B., Pickhardt, M., Mandelkow, E. Progress and Developments in Tau Aggregation Inhibitors for Alzheimer Disease. J Med Chem. 56 (11), 4135-4155 (2013).
- Cowan, C. M., Quraishe, S., Mudher, A. What is the pathological significance of tau oligomers. Biochem Soc Trans. 40 (4), 693-697 (2012).
- Spires-Jones, T. L., Kopeikina, K. J., Koffie, R. M., de Calignon, A., Hyman, B. T. Are tangles as toxic as they look. J Mol Neurosci. 45 (3), 438-444 (2011).
- SantaCruz, K., et al. Tau suppression in a neurodegenerative mouse model improves memory function. Science. 309 (5733), 476-481 (2005).
- Wittmann, C. W., et al. Tauopathy in Drosophila: neurodegeneration without neurofibrillary tangles. Science. 293 (5530), 711-714 (2001).
- Shulman, J. M., Feany, M. B. Genetic modifiers of tauopathy in Drosophila. Genetica. 165 (3), 1233-1242 (2003).
- Wille, H., Drewes, G., Biernat, J., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. Alzheimer-like paired helical filaments and antiparallel dimers formed from microtubule-associated protein tau in vitro. J Cell Biol. 118 (3), 573-584 (1992).
- Alonso, A., Zaidi, T., Novak, M., Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K. Hyperphosphorylation induces self-assembly of tau into tangles of paired helical filaments/straight filaments. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (12), 6923-6928 (2001).
- Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro. Methods Mol Biol. 299, 35-51 (2005).
- Wilson, D. M., Binder, L. I. Polymerization of microtubule-associated protein tau under near-physiological conditions. J Biol Chem. 270 (41), 24306-24314 (1995).
- Wilson, D. M., Binder, L. I. Free fatty acids stimulate the polymerization of tau and amyloid beta peptides. In vitro evidence for a common effector of pathogenesis in Alzheimer’s disease. Am J Pathol. 150 (6), 2181-2195 (1997).
- Perez, M., Valpuesta, J. M., Medina, M., Montejo de Garcini, E., Avila, J. Polymerization of tau into filaments in the presence of heparin: the minimal sequence required for tau-tau interaction. J Neurochem. 67 (3), 1183-1190 (1996).
- Carlson, S. W., et al. A complex mechanism for inducer mediated tau polymerization. Biochimica. 46 (30), 8838-8849 (2007).
- Goedert, M., et al. Assembly of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like filaments induced by sulphated glycosaminoglycans. Nature. 383 (6600), 550-553 (1996).
- King, M. E., Gamblin, T. C., Kuret, J., Binder, L. I. Differential assembly of human tau isoforms in the presence of arachidonic acid. J Neurochem. 74 (4), 1749-1757 (2000).
- Rankin, C. A., Sun, Q., Gamblin, T. C. Pseudo-phosphorylation of tau at Ser202 and Thr205 affects tau filament formation. Brain Res Mol Brain Res. 138 (1), 84-93 (2005).
- Rankin, C. A., Sun, Q., Gamblin, T. C. Pre-assembled tau filaments phosphorylated by GSK-3b form large tangle-like structures. Neurobiol Dis. 31 (3), 368-377 (2008).
- Grundke-Iqbal, I., et al. Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau (tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (13), 4913-4917 (1986).
- Castellani, R. J., Perry, G. Pathogenesis and disease-modifying therapy in Alzheimer’s disease: the flat line of progress. Arch Med Res. 43 (8), 694-698 (2012).
- Green, R. C., et al. Effect of tarenflurbil on cognitive decline and activities of daily living in patients with mild Alzheimer disease: a randomized controlled trial. JAMA. 302 (23), 2557-2564 (2009).
- Gauthier, S., et al. Effect of tramiprosate in patients with mild-to-moderate Alzheimer’s disease: exploratory analyses of the MRI sub-group of the Alphase study. J Nutr Health Aging. 13 (6), 550-557 (2009).
- Pickhardt, M., et al. Anthraquinones inhibit tau aggregation and dissolve Alzheimer’s paired helical filaments in vitro and in cells. J Biol Chem. 280 (5), 3628-3635 (2005).
- Crowe, A., Ballatore, C., Hyde, E., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. High throughput screening for small molecule inhibitors of heparin-induced tau fibril formation. Biochem Biophys Res Commun. 358 (1), 1-6 (2007).
- Taniguchi, S., et al. Inhibition of heparin-induced tau filament formation by phenothiazines, polyphenols, and porphyrins. J Biol Chem. 280 (9), 7614-7623 (2005).
- Sigurdsson, E. M. Tau-focused immunotherapy for Alzheimer’s disease and related tauopathies. Curr Alzheimer Res. 6 (5), 446-450 (2009).
- Tan, Y. J., et al. Phosphopeptide Enrichment with TiO-Modified Membranes and Investigation of Tau Protein Phosphorylation. Anal Chem. 85 (12), 5699-5706 (2013).
- Santa-Maria, I., Perez, M., Hernandez, F., Avila, J., Moreno, F. J. Characteristics of the binding of thioflavin S to tau paired helical filaments. J Alzheimers Dis. 9 (3), 279-285 (2006).
- Lira-De Leon, K. I., et al. Molecular mechanism of tau aggregation induced by anionic and cationic dyes. J Alzheimers Dis. 35 (2), 319-334 (2013).
- DiNitto, J. P., Wang, L., Wu, J. C. Continuous fluorescence-based method for assessing dicer cleavage efficiency reveals 3′ overhang nucleotide preference. BioTechniques. 48, 303-311 (2010).
- Maeda, S., et al. Granular tau oligomers as intermediates of tau filaments. Biochimica. 46 (12), 3856-3861 (2007).
- Pickhardt, M., et al. Phenylthiazolyl-hydrazide and its derivatives are potent inhibitors of tau aggregation and toxicity in vitro and in cells. Biochimica. 46 (35), 10016-10023 (2007).
- Rankin, C. A., Sun, Q., Gamblin, T. C. Tau phosphorylation by GSK-3beta promotes tangle-like filament morphology. Mol Neurodegener. 2, 12 (2007).
- McKee, A. C., et al. Chronic traumatic encephalopathy in athletes: progressive tauopathy after repetitive head injury. J Neuropathol Exp Neurol. 68 (7), 709-735 (2009).
- Herrup, K. Reimagining Alzheimer’s disease–an age-based hypothesis. J Neurosci. 30 (50), 16755-16762 (2010).
- Gavett, B. E., Stern, R. A., McKee, A. C. Chronic traumatic encephalopathy: a potential late effect of sport-related concussive and subconcussive head trauma. Clin Sports Med. 30 (1), 179-188 (2011).
- Tsitsopoulos, P. P., Marklund, N. Amyloid-beta Peptides and Tau Protein as Biomarkers in Cerebrospinal and Interstitial Fluid Following Traumatic Brain Injury: A Review of Experimental and Clinical Studies. Front Neurol. 4, 79 (2013).
