باستخدام البروتينات الفلورية لرصد ديناميات Glycosome في المثقبيات الأفريقي
Summary
Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.
Abstract
المثقبية البروسية هو طفيلي kinetoplastid الذي يسبب داء المثقبيات الأفريقي البشري (HAT)، أو مرض النوم، ومرض الهزال، ناغانا، في الماشية 1. المناوبين الطفيلي بين مجرى الدم من المضيف الثدييات وذبابة التسي تسي ناقلات. تكوين العديد من العضيات الخلوية يتغير استجابة لهذه الظروف خارج الخلية مختلفة 2-5.
Glycosomes هي peroxisomes درجة عالية من التخصص فيها العديد من الأنزيمات المشاركة في تحلل هي مجزأة. تغييرات تكوين Glycosome بطريقة التنموية وتنظيما للبيئة 4-11. حاليا، والتقنيات الأكثر شيوعا لدراسة ديناميات glycosome هي الإلكترون ومضان المجهري. التقنيات التي هي باهظة الثمن والوقت وكثيفة العمالة، وعدم تكييفها بسهولة لتحليل إنتاجية عالية.
للتغلب على هذه القيود، نظام مراسل الفلورسنت glycosome فيمما عزز الأصفر بروتين فلوري (EYFP) وتنصهر إلى تاكسدي استهداف تسلسل (PTS2)، التي توجه إلى انصهار بروتين glycosomes 12، أنشئت. عند الاستيراد من البروتين الانصهار PTS2eYFP، glycosomes تصبح الفلورسنت. تدهور عضية ونتائج إعادة التدوير في فقدان مضان التي يمكن قياسها عن طريق التدفق الخلوي. يمكن تحليل أعداد كبيرة من الخلايا (5،000 خلية / ثانية) في الوقت الحقيقي دون إعداد عينة واسعة مثل التثبيت والتركيب. تقدم هذه الطريقة وسيلة سريعة للكشف عن تغيرات في تكوين عضية استجابة لتغير الظروف البيئية.
Introduction
المثقبية البروسية يسبب مرض النوم الأفريقي في البشر ومرض الهزال، ناغانا، في الماشية. الأدوية المستخدمة في علاج هذه الأمراض العتيقة وسامة للغاية، واللقاحات غير متوفرة، وإمكانية تطوير مقاومة المخدرات تستلزم البحث عن أهداف جديدة المخدرات 1.
خلال دورة حياتها، T. البروسية، المناوبين بين ناقلات الامراض والحشرات والثدييات المضيفة. مضيفين أن تقديم بيئات مختلفة جدا التي الطفيلي يجب البقاء على قيد الحياة. يحدث عدد من التغيرات الأيضية والمورفولوجية كما يتعرض الطفيلي للظروف البيئية المختلفة. ويلاحظ بعض التغييرات الأكثر دراماتيكية في microbodies محددة الطفيلي يحدها غشاء واحد، يسمى glycosomes 13.
مستويات الجلوكوز مرتفعة نسبيا (~ 5 ملم) في مجرى الدم والطفيليات مجرى الدم (البنك السعودي الفرنسي) حصريا من خلال توليد ATP WH تحللوقمع الأيض الميتوكوندريا إيل 14. خلافا لحقيقيات النوى الأخرى التي يحدث تحلل في السيتوبلازم، T. البروسية compartmentalizes معظم الإنزيمات حال السكر في glycosomes 14،15. تؤخذ الطفيليات من قبل ذبابة التسي تسي خلال bloodmeal وتشهد انخفاض الجلوكوز، والذي يقع إلى مستويات غير قابلة للكشف خلال 15 دقيقة من بلعها بواسطة الطاير. عملية التمثيل الغذائي للحشرة، شكل procyclic (PCF)، والطفيليات هي أكثر مرونة والجلوكوز، وكذلك الأحماض الأمينية مثل البرولين، ويمكن استخدامها في تركيب ATP 16-18. دراسات البروتين المقارنة تكشف التغيرات في دورة حياة تعتمد glycosomal وبروتينات الميتوكوندريا مع البروتينات حال السكر زيادة في مجرى الدم والطفيليات بروتينات الميتوكوندريا المشاركة في دورة TCA والسلسلة التنفسية 13،19. في حين ركزت العديد من الدراسات على الاختلافات بين البنك السعودي الفرنسي وglycosomes PCF، لا يعرف إلا القليل عن التغيرات في glycosomes PCF التي تحدث ردا على الحياة الفطريةالتغييرات ironmental.
في المعى المؤخر من ذبابة، ومستويات الجلوكوز منخفضة مع الزيادات العابرة خلال التغذية 20. في معظم الدراسات في المختبر، وتزرع الطفيليات PCF في وسائل الإعلام التي تحتوي على الجلوكوز. ومع ذلك، فقد أظهرت الدراسات الحديثة أن التغييرات الأيض PCF بشكل كبير ردا على الجلوكوز توفر 17. في غياب الجلوكوز، وامتصاص البرولين والبرولين زيادة النشاط نازعة 18. هذا التغيير في استقلاب الميتوكوندريا المرجح يرافقه تغيير في تكوين glycosome والتشكل، ومع ذلك، لم يتم تقييم هذا مباشرة.
والإلكترون المجهري مضان والتقنيات الشائعة المستخدمة لدراسة ديناميات glycosome في T. 2،21-24 البروسية. هذه البروتوكولات هي الوقت والعمل المكثف، ومكلفة، وصعبة للتكيف مع الدراسات في الوقت الحقيقي والبروتوكولات إنتاجية عالية. للتغلب على هذا القيد، وهو نظام مراسل فلوري عضية-Uااا لدراسة العضيات في أنظمة الثدييات والخميرة تم تعديله للاستخدام في T. 12 البروسية.
وقد نظم مراسل الفلورسنت عضية تستخدم على نطاق واسع في حقيقيات النوى أعلى مثل الخميرة، والنبات، وخلايا الثدييات 25-27. في هذه النظم، وتنصهر بروتين فلوري إلى تسلسل الأحماض الأمينية التي يستهدف البروتين لعضيات محددة. يتم قياس تدهور أو تخليق البروتينات المستهدفة عبر مضان وتنعكس التغييرات في تكوين عضية بالتغيرات في مضان الخلية.
عندما تنصهر في إطار القراءة المفتوح المعززة بروتين فلوري الأصفر (EYFP) إلى النوع الثاني peroxisomal تسلسل استهداف (PTS2) 12، يتم استيراد البروتين PTS2eYFP إلى ناضجة، glycosomes استيراد المختصة ومضان يمكن رصدها عبر التدفق الخلوي. وتنعكس التغيرات في تكوين glycosome بالتغيرات في مضان الخلوية. هذا النظام يمكن أن تساعد في RESOLفينج الآليات التي تنظم التغييرات الناجمة بيئيا في glycosome التكوين.
تصف هذه المخطوطة توليد نظام مراسل glycosome في الطفيليات PCF بالتزامن مع التدفق الخلوي لمراقبة ديناميات glycosome الوقت الحقيقي في الطفيليات الحية وتقدم مثالا للكيفية التي تم استخدامها لمتابعة التغيرات في تكوين glycosome ردا على بيئات مختلفة. وباختصار، يتأثر glycosome التكوين حسب تركيزات الجلوكوز خارج الخلية ومرور ثقافات المرحلة السجل إلى وسائل الإعلام العذبة يؤدي تغيرات في تكوين glycosome. يمكن تعديل هذا النظام لدراسة السلوك الديناميكي من العضيات الأخرى في المثقبيات والطفيليات الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
Glycosomes هي، ديناميكية، العضيات الطفيلي محددة الأساسية. المرجح أن تشمل العمليات التي تنظم نشوء حيوي والصيانة وانتشار وإعادة عرض هذه العضيات أهداف المخدرات التي يمكن استغلالها لأغراض علاجية. على الرغم من وفرة كبيرة محتملة من هذه الأهداف المخدرات، وتخلفت مجال glycosome نشو?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the Creative Inquiry Program for Undergraduate Research and the Calhoun Honors College at Clemson University.
Materials
| Adenosine | Avocado Research Chemicals Ltd | A10781 | SDM79 Ingredient |
| L-Alanine | Avocado Research Chemicals Ltd | A15804 | SDM79 Ingredient |
| L-arginine | CalBiochem | 1820 | SDM79 Ingredient |
| p-aminobenzoic acid | ICN Biomedicals | 102569 | SDM79 Ingredient |
| Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100X) | Sigma | B6891 | SDM79 Ingredient |
| Biotin | Fisher | BP232-1 | SDM79 Ingredient |
| Calcium Chloride | VWR | BDH0224 | Cytomix |
| EDTA | Fisher | S311-100 | Cytomix ingredient |
| EZNA Gel Extraction kit | Omega Biotek | D2500-01 | DNA purifiation |
| Research grade Serum | Fisher | 03-600-511 | SDM79 Ingredient |
| Folic acid | ICN Biomedicals | 101725 | SDM79 Ingredient |
| Glucosamine HCl | ICN Biomedicals | 194671 | SDM79 Ingredient |
| Glucose | GIBCO | 15023-021 | SDM79 Ingredient |
| L-glutamine | CalBiochem | 3520 | SDM79 Ingredient |
| Glycerol | Acros Organics | Ac15892-0010 | Freezing media |
| Graces insect cell media powder | GIBCO | 11300-043 | SDM79 Ingredient |
| Hemin | MP Biomedicals | 194025 | SDM79 Ingredient |
| Guanosine | Avocado Research Chemicals Ltd | A11328 | SDM79 Ingredient |
| HEPES | MP Biomedicals | 194025 | SDM79 Ingredient |
| Magnesium Chloride | Fisher | BP214-500 | Cytomix ingredient |
| L-methionine | Fisher | BP388-100 | SDM79 Ingredient |
| MEM Amino Acids (50X) | Cellgro | 25-030-CI | SDM79 Ingredient |
| NEAA Mixture (100X) | Lonza | 13-114E | SDM79 Ingredient |
| Minimal Essential Medium (1X) with L-glutamine | Cellgro | 10-010-CM | SDM79 Ingredient |
| MOPS | Fisher | BP308-500 | SDM79 Ingredient |
| Sodium Biocarbonate | Fisher | S233-500 | SDM79 Ingredient |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Cellgro | 30-002-CI | SDM79 Ingredient |
| L-phenylalanine | ICN Biomedicals | 102623 | SDM79 Ingredient |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | Cytomix ingredient |
| Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisheer | P290-212 | Cytomix ingredient |
| L-proline | Fisher | BP392-100 | SDM79 Ingredient |
| L-serine | Acros Organics | 56-45-1 | SDM79 Ingredient |
| Pyruvic acid, sodium salt | Acros Organics | 113-24-6 | SDM79 Ingredient |
| L-taurine | TCI America | A0295 | SDM79 Ingredient |
| L-threonine | Acros Organics | 72-19-5 | SDM79 Ingredient |
| L-tyrosine | ICN Biomedicals | 103183 | SDM79 Ingredient |
| E.Z.N.A.Cycle Pure kit | Omega Biotek | D6492-02 | DNA purification |
| Binding buffer | Omega Biotek | PDR041 | DNA purification |
| SPW wash buffer | Omega Biotek | PDR045 | DNA purification |
| Gene Pulser Xcell | Biorad | 165-2660 | Trypanosome transformation |
| 4 mm electroporation cuvettes | VWR | Trypanosome transformation |
Riferimenti
- Stuart, K., et al. Kinetoplastids: related protozoan pathogens, different diseases. J Clin Invest. 118, 1301-1310 (2008).
- Herman, M., Perez-Morga, D., Schtickzelle, N., Michels, P. A. Turnover of glycosomes during life-cycle differentiation of Trypanosoma brucei. Autophagy. 4, 294-308 (2008).
- Herman, M., Gillies, S., Michels, P. A., Rigden, D. J. Autophagy and related processes in trypanosomatids: insights from genomic and bioinformatic analyses. Autophagy. 2, 107-118 (2006).
- Michels, P. A., Bringaud, F., Herman, M., Hannaert, V. Metabolic functions of glycosomes in trypanosomatids. Biochim Biophys Acta. 1763, 1463-1477 (2006).
- Michels, P. A., et al. Peroxisomes, glyoxysomes and glycosomes (review). Mol Membr Biol. 22, 133-145 (2005).
- Moyersoen, J., Choe, J., Fan, E., Hol, W. G., Michels, P. A. Biogenesis of peroxisomes and glycosomes: trypanosomatid glycosome assembly is a promising new drug target. FEMS Microbiol Rev. 28, 603-643 (2004).
- Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes. Molecular and biochemical parasitology. 115, 19-28 (2001).
- Parsons, M. Glycosomes: parasites and the divergence of peroxisomal purpose. Mol Microbiol. 53, 717-724 (2004).
- Michels, P. A., Hannaert, V., Bringaud, F. Metabolic aspects of glycosomes in trypanosomatidae – new data and views. Parasitol Today. 16, 482-489 (2000).
- Michels, P. A., Hannaert, V. The evolution of kinetoplastid glycosomes. J Bioenerg Biomembr. 26, 213-219 (1994).
- Hannaert, V., Michels, P. A. Structure function, and biogenesis of glycosomes in kinetoplastida. J Bioenerg Biomembr. 26, 205-212 (1994).
- Bauer, S., Morris, J. C., Morris, M. T. Environmentally regulated glycosome protein composition in the african trypanosome. Eukaryot Cell. 12, 1072-1079 (2013).
- Colasante, C., Ellis, M., Ruppert, T., Voncken, F. Comparative proteomics of glycosomes from bloodstream form and procyclic culture form Trypanosoma brucei brucei. Proteomics. 6, 3275-3293 (2006).
- Opperdoes, F. R. Compartmentation of carbohydrate metabolism in trypanosomes. Annu Rev Microbiol. 41, 127-151 (1987).
- Kessler, P. S., Parsons, M. Probing the role of compartmentation of glycolysis in procyclic form Trypanosoma brucei: RNA interference studies of PEX14, hexokinase, and phosphofructokinase. The Journal of biological chemistry. 280, 9030-9036 (2005).
- Bringaud, F., Riviere, L., Coustou, V. Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources. Molecular and biochemical parasitology. 149, 1-9 (2006).
- Coustou, V., et al. Glucose-induced remodeling of intermediary and energy metabolism in procyclic Trypanosoma brucei. The Journal of biological chemistry. 283, 16342-16354 (2008).
- Lamour, N., et al. Proline metabolism in procyclic Trypanosoma brucei is down-regulated in the presence of glucose. The Journal of biological chemistry. 280, 11902-11910 (2005).
- Vertommen, D., et al. Differential expression of glycosomal and mitochondrial proteins in the two major life-cycle stages of Trypanosoma brucei. Molecular and biochemical parasitology. 158, 189-201 (2008).
- Vickerman, K. Developmental cycles and biology of pathogenic trypanosomes. British medical bulletin. 41, 105-114 (1985).
- Lorenz, P., Maier, A. G., Baumgart, E., Erdmann, R., Clayton, C. Elongation and clustering of glycosomes in Trypanosoma brucei overexpressing the glycosomal Pex11p. The EMBO journal. 17, 3542-3555 (1998).
- Saveria, T., et al. Conservation of PEX19-binding motifs required for protein targeting to mammalian peroxisomal and trypanosome glycosomal membranes. Eukaryot Cell. 6, 1439-1449 (2007).
- Banerjee, S. K., Kessler, P. S., Saveria, T., Parsons, M. Identification of trypanosomatid PEX19: functional characterization reveals impact on cell growth and glycosome size and number. Molecular and biochemical parasitology. 142, 47-55 (2005).
- Milagros Camara Mde, L., Bouvier, L. A., Miranda, M. R., Pereira, C. A. Identification and validation of Trypanosoma cruzi’s glycosomal adenylate kinase containing a peroxisomal targeting signal. Experimental parasitology. 130, 408-411 (2012).
- Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules. The Journal of cell biology. 136, 71-80 (1997).
- Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER. The Journal of cell biology. 173, 521-532 (2006).
- Hoepfner, D., Schildknegt, D., Braakman, I., Philippsen, P., Tabak, H. F. Contribution of the endoplasmic reticulum to peroxisome formation. Cell. 122, 85-95 (2005).
- Furuya, T., et al. Glucose is toxic to glycosome-deficient trypanosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14177-14182 (2002).
