Summary

형광 단백질을 사용하면 아프리카 Trypanosome에서 Glycosome 역학을 모니터링하려면

Published: August 19, 2014
doi:

Summary

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

Abstract

Trypanosoma brucei는 가축 일에, 인간의 아프리카 트리파노소마 증 (HAT) 또는 수면 질병 및 소모성 질환, nagana 원인 kinetoplastid 기생충이다. 포유류의 호스트의 혈류와 체체 파리 벡터 사이의 기생충 번갈아. 많은 세포 소기관의 구성은 서로 다른 세포 외 조건 2-5에 대한 응답으로 변경됩니다.

Glycosomes은 작용에 관여하는 효소의 많은 실형되는 고도로 전문화 페 록시이다. 개발과 환경 규제 방식 4-11 Glycosome 구성이 변경됩니다. 현재 glycosome 역학을 연구하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 기술은 전자와 형광 현미경 아르; 비싸고, 시간과 노동 집약적 및 고 처리량 분석에 쉽게 적응하지 않은 방법.

이러한 제한, 형광등 glycosome 기자 시스템을 극복하기 위해12 glycosomes하는 융합 단백질을 지시하는 퍼 옥시 대상 시퀀스 (PTS2)에 융합되는 노란색 형광 단백질 (EYFP)를 강화하는 설립되었습니다. PTS2eYFP 융합 단백질의 수입시에, glycosomes 형광된다. 소기관 저하 및 유동 세포 계측법에 의해 측정 될 수있는 형광 손실 재활용 결과. 셀은 다수의 (5000 세포 / 초)와 같은 고정 및 장착으로 광범위한 샘플 준비없이 실시간으로 분석 할 수있다. 이 방법은 환경 조건의 변동에 응답하여 소기관 조성의 변화를 검출 신속한 방법을 제공한다.

Introduction

Trypanosoma brucei 소 아프리카 인간 수면병 및 소모성 질환, nagana을 발생합니다. 이들 질환의 치료에 사용되는 약물은 백신을 사용할 수없는, 낡은 매우 독성이며, 약제 내성의 개발을위한 잠재적 인 신규 약물 표적에 대한 검색을 필요로한다.

수명주기, T.brucei, 곤충 벡터와 포유류의 호스트 번갈아; 기생충이 생존해야하는 매우 다른 환경을 제시 두 호스트. 기생충이 상이한 환경 조건에 노출되는 형태로 대사 및 변경이 발생할 수. 가장 극적인 변화 중 일부는 단일 막 경계 기생충 특정 microbodies에서 관찰되고, glycosomes 13 불린다.

포도당 수준이 상대적으로 높은 아르 (~ 5 mM)을 혈류와 혈류 기생충 (BSF)의 작용도 ë 통해 독점적으로 ATP를 생성ILE 미토콘드리아 대사는 14을 억압한다. 다른 진핵 달리하는 작용은 세포질에서 발생 T. brucei는 glycosomes (14, 15)에서 당분 해 효소의 대부분을 compartmentalizes. 기생충은 bloodmeal 동안 체체 파리에 의해 촬영 및 즉석 섭취되는 15 분 이내에 발견 할 수없는 수준으로 떨어지는 혈당 강하를 경험하게된다. 곤충들의 대사, procyclic 형태 (PCF)는 기생충보다 유연하고 글루코스뿐만 아니라, 프롤린 등의 아미노산, ATP 16-18의 합성에 사용될 수있다. 비교 단백체 연구는 라이프 사이클 glycosomal에 따라 변화와 혈류 기생충 증가 당분 단백질과 미토콘드리아 단백질과 TCA 사이클과 호흡 체인 13, 19에 관여하는 미토콘드리아 단백질을 알 수있다. 많은 연구가 BSF와 PCF glycosomes의 차이점에 초점을 맞추고있는 반면, 거의 ENV에 대한 응답으로 발생하는 PCF의 glycosomes의 변화에​​ 대해 알려진ironmental 변경됩니다.

파리의 hindgut에서 포도당 수준은 수유 20시 일시적인 증가로 낮다. 시험 관내 (in vitro) 연구에서 대부분으로, PCF 기생충은 포도당을 포함하는 배지에서 재배되고 있습니다. 그러나, 최근의 연구는 크게 님의 PCF 대사 변경 가용성 17 포도당 것을 증명하고있다. 글루코오스, 프롤린 흡수 및 프롤린 탈수소 효소 활성의 증가 (18)의 부재. 미토콘드리아 대사의 변화가 예상 glycosome 조성물 및 형태의 변화를 수반하지만, 이것은 직접 평가되지 않았다.

전자 및 형광 현미경은 일반적인 기술은 T.에 glycosome 역학을 연구하는 데 사용됩니다 brucei 2,21-24. 이러한 프로토콜은 시간 및 비용이 많이, 실시간 연구 및 높은 처리량 프로토콜에 적응하기 어려운 노동이다. , 소기관 형광 리포터 시스템을 U 이러한 한계를 극복하기 위해포유류와 효모 시스템의 세포 기관을 공부 나오지는 T.에 사용하기 위해 수정되었습니다 brucei 12.

형광등 – 세포 소기관 기자 시스템은 광범위하게 효모, 식물 및 동물 세포 25 ~ 27로 높은 진핵 생물에서 사용되어왔다. 이러한 시스템에서, 형광 단백질은 특정 세포 내 소기관으로 단백질을 표적 아미노산 서열에 융합된다. 대상 단백질의 분해 나 합성은 형광을 통해 측정되고, 세포 기관의 구성의 변화는 세포의 형광의 변화에​​ 의해 반영됩니다.

강화 된 노란색 형광 단백질 (EYFP)의 오픈 리딩 프레임 타입 II 페 록시 타겟팅 시퀀스 (PTS2) 12에 융합 될 때, PTS2eYFP 단백질 성숙, 수입 능력 glycosomes 형광으로 가져가 유동 세포 계측법을 통해 모니터링 할 수 있습니다. glycosome 조성의 변화는 세포의 형광의 변화에​​ 의해 반영됩니다. 이 시스템은 레졸에 도움이 될 수 있습니다glycosome 조성물 중의 환경 변화에 의한 규제 메커니즘 ving.

이 원고 생방송 기생충 실시간 glycosome 역학을 모니터링하는 유동 세포 계측법과 관련 PCF 기생충에 glycosome 리포터 시스템의 생성을 설명하고, 그것이 다른 환경에 응답 glycosome 조성의 변화를 수행하기 위해 사용 된 방법의 예를 제공한다. 신선한 미디어 glycosome 구성의 변화를 트리거로 요약하면, glycosome 조성물은 세포의 포도당 농도와 로그 상 문화의 통과에 의해 영향을 받는다. 이 시스템은 트리 파노 솜 및 기타 기생충의 다른 세포 소기관의 동적 거동을 연구하기 위해 수정 될 수 있습니다.

Protocol

1 일반 Trypanosome 축산 SDM79 미디어 준비 (표 1)에 대한 고체의 무게를 측정. 4 50 ML 원뿔에서 °의 C 또는 지퍼락 백에 보관하십시오. 참고 : 시약 6 개월 이상 안정적이다. 해동 소 태아 37 ° C의 수조에서 혈청 (FBS), 그리고 반전에 의해 주기적으로 섞는다. 참고 : FBS는 멸균 솔루션으로 공급 업체에서 수신된다. FBS 살균 필터 기생충의 성장을 지원하는 능력을 감소시?…

Representative Results

이 시스템에서, glycosome 조성물 글루코스 의존적 변화가 관찰되었다. 세포가 포도당 함유 미디어에서 재배 될 때,이 인구가 관찰된다; 한 밝고 한 희미한 (그림 2A). 희미한 세포는 밝은 세포가 성숙하고 미성숙 glycosomes (12)의 혼합물을 항구 동안 PTS2eYFP을 가져 오지 않은 미숙 glycosomes를 항구. 포도당 미디어에 존재하는 경우, glycosome 단백질의 mislocalization는 15,28 치명적?…

Discussion

Glycosomes은 필수, 동적, 기생충 특정 세포 기관이다. 이러한 세포 소기관의 생합성, 유지 보수, 증식과 리모델링을 조절하는 과정은 가능성이 치료 목적으로 악용 될 수 약물 표적을 포함한다. 이러한 약물 표적의 가능성이 높은 풍부 불구 glycosome 생합성의 필드는 주로 급격한 동적, 소기관 반응을 모니터링하는 다루기 쉬운, 높은 스루풋 시스템의 부족으로, 다른 유기체와 유사한 프로세스를 연구 …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was funded by the Creative Inquiry Program for Undergraduate Research and the Calhoun Honors College at Clemson University.

Materials

Adenosine Avocado Research Chemicals Ltd A10781 SDM79 Ingredient
L-Alanine Avocado Research Chemicals Ltd A15804 SDM79 Ingredient
L-arginine CalBiochem 1820 SDM79 Ingredient
p-aminobenzoic acid ICN Biomedicals 102569 SDM79 Ingredient
Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100X) Sigma B6891 SDM79 Ingredient
Biotin Fisher BP232-1 SDM79 Ingredient
Calcium Chloride VWR BDH0224 Cytomix
EDTA Fisher S311-100 Cytomix ingredient
EZNA Gel Extraction kit Omega Biotek D2500-01 DNA purifiation
Research grade Serum Fisher 03-600-511 SDM79 Ingredient
Folic acid ICN Biomedicals 101725 SDM79 Ingredient
Glucosamine HCl ICN Biomedicals 194671 SDM79 Ingredient
Glucose GIBCO 15023-021 SDM79 Ingredient
L-glutamine CalBiochem 3520 SDM79 Ingredient
Glycerol Acros Organics Ac15892-0010 Freezing media
Graces insect cell media powder GIBCO 11300-043 SDM79 Ingredient
Hemin MP Biomedicals 194025 SDM79 Ingredient
Guanosine Avocado Research Chemicals Ltd A11328 SDM79 Ingredient
HEPES MP Biomedicals 194025 SDM79 Ingredient
Magnesium Chloride Fisher BP214-500 Cytomix ingredient
L-methionine Fisher BP388-100 SDM79 Ingredient
MEM Amino Acids (50X) Cellgro 25-030-CI SDM79 Ingredient
NEAA Mixture (100X) Lonza 13-114E SDM79 Ingredient
Minimal Essential Medium (1X) with L-glutamine Cellgro 10-010-CM SDM79 Ingredient
MOPS Fisher BP308-500 SDM79 Ingredient
Sodium Biocarbonate Fisher S233-500 SDM79 Ingredient
Penicillin-Streptomycin Solution Cellgro 30-002-CI SDM79 Ingredient
L-phenylalanine ICN Biomedicals 102623 SDM79 Ingredient
Potassium Chloride Fisher P217-500 Cytomix ingredient
Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisheer P290-212 Cytomix ingredient
L-proline Fisher BP392-100 SDM79 Ingredient
L-serine Acros Organics 56-45-1 SDM79 Ingredient
Pyruvic acid, sodium salt Acros Organics 113-24-6 SDM79 Ingredient
L-taurine TCI America A0295 SDM79 Ingredient
L-threonine Acros Organics 72-19-5 SDM79 Ingredient
L-tyrosine ICN Biomedicals 103183 SDM79 Ingredient
E.Z.N.A.Cycle Pure kit Omega Biotek D6492-02 DNA purification
Binding buffer Omega Biotek PDR041 DNA purification
SPW wash buffer  Omega Biotek PDR045 DNA purification
Gene Pulser Xcell  Biorad 165-2660 Trypanosome transformation
4 mm electroporation cuvettes VWR Trypanosome transformation

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Citazione di questo articolo
Bauer, S., Conlon, M., Morris, M. Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome. J. Vis. Exp. (90), e51647, doi:10.3791/51647 (2014).

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