Generatie en zuivering van Human INO80 chromatine remodeling Complexen en subes
Summary
Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het genereren en het zuiveren van wild type en mutante versies van de menselijke INO80 chromatin remodelling complex. Epitoop-gemerkte versies van INO80 subeenheden zijn stabiel tot expressie gebracht in HEK293-cellen en volledige complexen en complexen ontbreekt specifieke sets van subeenheden gezuiverd door immuno-affiniteitschromatografie.
Abstract
INO80 chromatine remodeling complexen reguleren nucleosomen en DNA bereikbaarheid door het katalyseren van ATP-afhankelijke nucleosoom remodeling. Menselijke INO80 complexen uit 14 eiwitsubeenheden waaronder INO80 een SNF2-achtige ATPase, dat dient als de katalytische subeenheid en de matrix voor montage van de complexen. Functies van de andere subeenheden en de mechanismen waarmee zij een bijdrage leveren aan chromatine remodeling activiteit de INO80 complex blijft slecht begrepen, voor een deel te wijten aan de uitdaging van het genereren van INO80 bouwgroepen in menselijke cellen of heterologe expressie systemen. Deze JOVE protocol beschrijft een procedure die zuivering van menselijke INO80 chromatine hermodellering subcomplexen die ontbreken een subeenheid of een subset van subeenheden mogelijk maakt. N-eindstandig FLAG epitoop-gemerkte cDNA INO80 worden stabiel ingebracht in humane embryonale nier (HEK) 293-cellijnen met Flp-bemiddelde recombinatie. Indien een subset van subeenheden van de INO80 complex is be verwijderd, een expressie plaats INO80 mutante eiwitten die het platform te monteren onderdelen van deze subeenheden missen. In het geval een individu subunit is uitgeput te raken, een transfects siRNA gericht op deze subeenheid in een HEK 293 cellijn stabiel tot expressie FLAG tag INO80 ATPase. Kernextracten worden bereid, en FLAG immunoprecipitaties wordt uitgevoerd om proteïne fracties die INO80 derivaten verrijken. De samenstellingen van gezuiverde INO80 subcomplexen kan vervolgens worden geanalyseerd met methoden zoals immunoblotting, zilverkleuring en massaspectrometrie. De INO80 en INO80 subes gegenereerd volgens dit protocol kan verder worden geanalyseerd middels diverse biochemische assays die worden beschreven in de bijgevoegde JOVE protocol. De hier beschreven werkwijzen kunnen worden aangepast voor onderzoek van de structurele en functionele eigenschappen van elke zoogdierlijke meerdere subeenheden chromatine remodeling en modificerende complexen.
Introduction
Evolutionair geconserveerd SNF2 familie chromatine remodeling complexen zijn belangrijke regulatoren van chromatine organisatie en toegankelijkheid van DNA 1. Deze remodeling complexen altijd een centrale SNF2-achtige ATPase subeenheid, die in sommige gevallen, assembleert diverse toe eiwitten en vormt meerdere subeenheden macro-moleculaire assemblages. De moleculaire details van de ATP-afhankelijke chromatine remodeling te bestuderen, is het belangrijk om de bijdrage van bepaalde subsets van subeenheden en / of domein structuren begrijpen activiteiten van de complexen. Dergelijke analyses vereisen de mogelijkheid om zeer gezuiverde mutant complexen die bepaald eiwit subeenheden of domein structuren missen genereren.
Vorige structuur-functie studies van ATP-afhankelijke chromatine hermodellering complexen sterk gericht op de gist modelsysteem vanwege de superieure maakbaarheid van de gist genoom (zie bijvoorbeeld refs 1-4). Gezien het behoud van desubunit samenstelling en functionaliteit tussen orthologe remodeling complexen, hebben studies van de structuur en functie van gist remodeling complexen belangrijke inzichten in hun tegenhangers in hogere eukaryoten. Toch merkbare soortspecifieke verschillen tussen remodeling complexen bestaan, als gevolg van winst of verlies van soortspecifieke subeenheden, winst of verlies van de soort-specifieke domeinen van geconserveerde subeenheden en sequentievariabiliteit binnen geconserveerde domeinen van geconserveerde subeenheden. Dergelijke verschillen kunnen in principe gedreven door de behoefte aan hogere eukaryote cellen aan te passen aan nieuwe moleculaire en cellulaire omgevingen. Zo begrijpen hoe subeenheden van hogere eukaryote remodeling complexen bijdragen aan het nucleosoom remodeling proces is waardevol, want het werpt niet alleen licht op de basismechanismen van de ATP-afhankelijke chromatine remodeling proces, maar ook kan waardevolle inzichten verschaffen in de mechanismen die chromatine structuur en genexpressie in highaar eukaryoten worden gereguleerd.
Tot nu toe zijn er slechts beperkte structurele en functionele studies van multi-subunit van zoogdieren chromatine remodeling complexen, mede als gevolg van de moeilijkheden bij het verkrijgen van biochemisch gedefinieerd chromatine remodeling complexen en subes. We hebben gedeeltelijk omzeild deze moeilijkheden met de hieronder beschreven procedures, waarbij immunoaffiniteitszuivering wordt gebruikt om intact INO80 of INO80 subcomplexen van humane cellen die stabiel tot expressie N-eindstandig FLAG epitoop-gemerkte wild type of mutante versies van INO80 5-7 bereiden (figuur 1) . Om intact INO80 complexen van menselijke cellen te verkrijgen, is Flp-bemiddelde recombinatie wordt gebruikt om transgene HEK293 cellijnen die stabiel FLAG epitoop-gemerkte cDNA's die coderen voor subeenheden van het INO80 complex 8-10 genereren. Omdat overexpressie van INO80 subeenheden enigszins giftig zijn, is het noodzakelijk te isoleren en klonale cellijnen onder selectieve co handhavennditions stabiele transgene expressie waarborgen tijdens de vele passages nodig zijn voor uitbreiding van grootschalige celkweken. Voor kleinere INO80 subcomplexen dat slechts een subset van subeenheden bevatten verkrijgen, hebben we succes twee methoden (figuur 2A, B). In de eerste genereren we HEK293 Flp-In cellijnen die stabiel mutant versies van INO80 die domeinen voor de interactie met specifieke subeenheden 5 ontbreken. Alternatief wordt siRNA-gemedieerde knockdown gebruikt om de gewenste subeenheid van cellen die een geschikt FLAG gelabeld INO80 subeenheid (ongepubliceerde gegevens) afbreken. Tot slot, om het menselijk INO80 complexen te zuiveren, is FLAG agarose gebaseerd chromatografie 11 gebruikt om een-INO80 bevattende fractie een verrijking van nucleaire extracten, waardoor de effectieve vermindering van de aanwezigheid van verontreinigende cytosole eiwitten in de laatste fractie die gezuiverd INO80 of INO80 subes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Structurele en functionele studies van multi-subunit van zoogdieren chromatine remodeling complexen van hogere eukaryoten werden gehinderd door de moeilijkheid van de voorbereiding van biochemisch nuttige hoeveelheden van dergelijke complexen met mutant subeenheden of ontbreken bepaalde subeenheden helemaal. Er zijn een aantal technische hindernissen Enerzijds, is genetische manipulatie in zoogdiercellen technisch ingewikkeld en tijdrovend geweest. Unlike gistcellen, waarvan het genoom kan gemakkelijk worden bewerkt en …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk in het laboratorium van de auteurs 'wordt ondersteund door een subsidie van de National Institute of General Medical Sciences (GM41628) en door een subsidie aan de Stowers Instituut voor Medisch Onderzoek van het Helen Nelson Fonds Medisch Onderzoek aan de Greater Kansas City Community Foundation.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cellgro | 10-013-CV | |
| Glutamax-I (stablized glutamine) | Life Technologies | 35050-079 | |
| Fetal Bovine Serum | SAFC | 12176C | |
| FuGENE6 transfection reagent | Promega | E2312 | |
| Hygromycin B, sterile in PBS | AG Scientific | H-1012-PBS | |
| pcDNA5/FRT vector | Life Technologies | V6010-20 | |
| Flp-In HEK293 cells | Life Technologies | R780-07 | |
| pOG44 Flp-Recombinase Expression Vector | Life Technologies | V600520 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | F2426 | |
| calf serum | SAFC | 12138C | |
| TARGETplus SMARTsiRNA pool | Dharmacon / Thermo Scientific | various | |
| 5x siRNA resuspension buffer | Dharmacon / Thermo Scientific | #B-002000-UB-100 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Life Technologies | 51985-091 | |
| PBS | Cellgro | 45000 | VWR |
| TrypLE (trypsin) | Life Technologies | 12604 | |
| 1x FLAG Peptide | Sigma | F3290 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Column | Bio-Rad | 737-5021 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO) | Amicon | UFC805024 | Fisher Scientific |
| Zeba Desalting Columns | Thermo Scientific | 89882 | |
| Anti-FLAG M2 antibody, mouse | Sigma | F3165 | |
| Anti-FLAG M2 antibody, rabbit | Sigma | F7425 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | |
| benzonase | Novagen | 70664 | |
| Equipment | Company | ||
| Wheaton Dounce Tissue Grinders | Wheaton | 06-435C | |
| JS-4.2 rotor in a J6 centrifuge | Beckman-Coulter | 339080 | |
| JA-17 rotor | Beckman-Coulter | 369691 | |
| 10 ml polycarbonate tubes | Beckman-Coulter | 355630 | |
| 70 ml polycarbonate bottles | Beckman-Coulter | 355655 | |
| Type 45 Ti rotor | Beckman-Coulter | 339160 | |
| Type 70.1 Ti rotor | Beckman-Coulter | 342184 | |
| BD Clay Adams Nutator Mixer | BD Diagnostics | 15172-203 | VWR |
| Glas-Col Tube/Vial Rotator | Glas-Col | 099A RD4512 | |
| PCR thermal cycler PTC 200 | MJ Research | PTC 200 | |
| roller bottle incubator | Bellco biotechnology | 353348 | |
| Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4 | Millipore | IPFL07810 | |
| lubricated 1.5ml microcentrifuge tubes | Costar | 3207 |
Riferimenti
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. The biology of chromatin remodeling complexes, Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).
- Szerlong, H., Hinada, K., Viswanathan, R., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Cairns, B. R. The HSA domain binds nuclear actin-related proteins to regulate chromatin-remodeling ATPases. Nature Struct. Mol. Biol. 15 (5), 469-476 (2008).
- Shen, X., Mizuguchi, G., Hamiche, A., Wu, C. A chromatin remodelling complex involved in transcription and DNA processing. Nature. 406 (6795), 541-544 (2000).
- Shen, X., Ranallo, R., Choi, E., Wu, C. Involvement of actin-related proteins in ATP-dependent chromatin remodelling. Mol. Cell. 12, 147-155 (2003).
- Chen, L., et al. Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling. Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).
- Sauer, B. Site-specific recombination: developments and applications. 5 (5), 521-527 (1994).
- Gorman, S., Fox, D. T., Wahl, G. M. Recombinase-mediated gene activation and site-specific integration in mammalian cells. Science. 251 (4999), 1351-1355 (1991).
- Jin, J., et al. A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex. Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (2005).
- Cai, Y., et al. YY1 functions with INO80 to activate transcription. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (9), 872-874 (2007).
- Yao, T., et al. Distinct Modes of Regulation of the Uch37 Deubiquitinating Enzyme in the Proteasome and in the Ino80 Chromatin-Remodeling Complex. Mol.Cell. 31 (6), 909-917 (2008).
- Brizzard, B. L., Chubet, R. G., Vizard, D. L. Immunoaffinity purification of FLAG epitope-tagged bacterial alkaline phosphatase using a novel monoclonal antibody and peptide elution, Biotechniques. 16 (4), 730-735 (1994).
- Barker, K. . At the Bench: A Laboratory Navigator. 10, 207-245 (2005).
- Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian cell nuclei. Nucleic. Acids. Res. 11 (5), 1475-1489 (1983).
