Production et purification des droits de INO80 remodelage de la chromatine Complexes et Subcomplexes
Summary
Ce protocole décrit un procédé pour la production et la purification de type sauvage et les versions mutantes du complexe de remodelage de la chromatine humaine INO80. Marquage épitopique versions de sous-unités INO80 sont exprimés de manière stable dans des cellules HEK293, et les complexes et les complexes dépourvus complets des ensembles spécifiques de sous-unités sont purifiés par chromatographie d'immuno-affinité.
Abstract
INO80 complexes de remodelage réguler la dynamique du nucléosome et l'accessibilité de l'ADN en catalysant ATP-dépendant nucléosome remodelage. Complexes INO80 humaines se composent de 14 sous-unités protéiques dont Ino80, une ATPase SNF2 comme, qui sert à la fois de la sous-unité catalytique et l'échafaud pour l'assemblage des complexes. Fonctions des autres sous-unités et les mécanismes par lesquels ils contribuent à l'activité de remodelage de la chromatine du complexe INO80 restent mal connus, en partie en raison de la difficulté de générer des sous-ensembles de INO80 dans les cellules humaines ou systèmes d'expression hétérologues. Ce protocole de JOVE décrit une procédure qui permet la purification de INO80 chromatine Subcomplexes de remodelage humaines qui font défaut une sous-unité ou un sous-ensemble de sous-unités. N-terminale de l'épitope FLAG Ino80 ADNc marqués de manière stable sont introduits dans le rein embryonnaire humain (HEK) 293 lignes de cellules en utilisant la recombinaison médiée par Flp. Dans le cas où un sous-ensemble des sous-unités du complexe à b est INO80e supprimé, on exprime des protéines mutantes INO80 place qui n'ont pas la plate-forme nécessaire pour l'assemblage de ces sous-unités. Dans le cas d'une sous-unité individuelle doit être appauvri, un transfecte siRNA ciblant cette sous-unité dans une ligne HEK 293 cellules exprimant de façon stable FLAG marqués Ino80 ATPase. Des extraits nucléaires sont préparés, et FLAG immumoprécipitées d'enrichir fractions protéiques contenant des dérivés de INO80. Les compositions de sous-complexes de INO80 purifiés peuvent ensuite être analysées en utilisant des méthodes telles que immunoblot, coloration à l'argent, et la spectrométrie de masse. Les Subcomplexes INO80 et INO80 générés selon ce protocole peuvent être analysées en utilisant différents dosages biochimiques, qui sont décrites dans le protocole de JOVE d'accompagnement. Les méthodes décrites ici peuvent être adaptées pour l'étude des propriétés structurales et fonctionnelles de tout sous-unités multiples remodelage de la chromatine chez les mammifères et les complexes de modification.
Introduction
Complexes de remodelage de la famille SNF2 évolutives conservées sont des régulateurs clés de l'organisation de la chromatine et de l'ADN accessibilité 1. Ces complexes de remodelage comprennent toujours une sous-unité ATPase de SNF2 central en forme, ce qui, dans certains cas, les assemble avec différents accessoires et des protéines formant des ensembles de macro-moléculaire sous-unités multiples. Pour étudier les détails moléculaires des processus de remodelage de la chromatine dépendant de l'ATP, il est important de comprendre les contributions des sous-ensembles de données de sous-unités et / ou des structures de domaine pour les activités des complexes. Ces analyses doivent être capables de générer des complexes mutants hautement purifiés qui manquent particulier sous-unités protéiques ou des structures de domaine.
Des études antérieures structure-fonction de complexes de remodelage de la chromatine dépendant de l'ATP ont largement centrée sur le système de levure modèle en raison de la manipulabilité supérieure du génome de la levure (voir, par exemple, 1-4) refs. Compte tenu de la conservation decomposition de la sous-unité et la fonctionnalité entre complexes de remodelage orthologues, des études de la structure et la fonction des complexes de remodelage de levure ont fourni des informations importantes sur leurs homologues chez les eucaryotes supérieurs. Néanmoins, il n'existe spécifiques aux espèces sensibles différences entre les complexes de remodelage, résultant de gain ou de perte de sous-unités spécifiques de l'espèce, le gain ou la perte de domaines spécifiques à l'espèce de sous-unités conservées, et la variabilité de séquence dans des domaines conservés de sous-unités conservées. Ces différences ne peuvent en principe être motivées par la nécessité pour les cellules eucaryotes supérieures à s'adapter à de nouveaux environnements moléculaires et cellulaires. Ainsi, comprendre comment les sous-unités de complexes de remodelage eucaryotes supérieurs contribuent au processus de remodelage du nucléosome est précieux, non seulement parce qu'il met en lumière les mécanismes de base du processus de remodelage de la chromatine dépendant de l'ATP, mais peut également fournir de précieuses informations sur les mécanismes par lesquels la structure de la chromatine et l'expression des gènes dans higses eucaryotes sont réglementés.
Jusqu'à présent, il ya eu seulement limité études structurales et fonctionnelles de plusieurs sous-unités de mammifères complexes de remodelage, en partie en raison des difficultés à obtenir des complexes de remodelage de la chromatine biochimiquement définies et Subcomplexes. Nous avons partiellement contourné ces difficultés avec les procédures décrites ci-dessous, dans lequel la purification par immuno-affinité est utilisé pour préparer intactes INO80 ou INO80 Subcomplexes de cellules humaines exprimant de façon stable N-terminale épitope FLAG étiqueté de type sauvage ou des versions mutantes de Ino80 5-7 (Figure 1) . Pour obtenir des complexes de INO80 intactes à partir de cellules humaines, la recombinaison médiée par Flp est utilisée pour générer des lignées de cellules HEK293 exprimant de manière stable transgéniques épitope FLAG ADNc codant pour des sous-unités de la catégorie du complexe INO80 8-10. Étant donné que la surexpression de sous-unités de INO80 peut être quelque peu toxique, il est nécessaire d'isoler et de conserver les lignées cellulaires clonales de moins de co sélectifnditions pour assurer l'expression stable du transgène au cours des nombreux passages nécessaires à l'expansion de cultures cellulaires à grande échelle. Pour obtenir Subcomplexes de INO80 petits qui contiennent un sous-ensemble de sous-unités, nous avons utilisé avec succès deux approches (Figure 2A, B). Dans la première, on génère des lignées cellulaires HEK293 Flp-In exprimant de manière stable les versions mutantes de Ino80 domaines qui n'ont pas requis pour l'interaction avec les sous-unités spécifiques 5. Sinon, knockdown siARN médiation est utilisée pour épuiser la sous-unité souhaitée à partir de cellules exprimant une sous-unité de INO80 étiquetée FLAG approprié (données non publiées). Enfin, pour purifier les complexes INO80 humaines, FLAG chromatographie à base d'agarose 11 est utilisé pour enrichir une fraction contenant INO80-à partir d'extraits nucléaires, réduisant ainsi efficacement la présence de protéines contaminantes cytosoliques dans la fraction finale contenant INO80 ou INO80 Subcomplexes purifiés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Études structurales et fonctionnelles de plusieurs sous-unités des complexes de mammifères de remodelage du eucaryotes supérieurs ont été entravés par la difficulté de préparer biochimiquement des quantités utiles de ces complexes contenant des sous-unités mutantes ou manquant certaines sous-unités au total. Il ya un certain nombre d'obstacles techniques: d'abord, la manipulation génétique dans les cellules de mammifères a été techniquement difficile et de longue haleine. A la différence des ce…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Travail dans le laboratoire des auteurs est financé par une subvention de l'Institut national des sciences médicales générales (GM41628) et par une subvention de l'Institut Stowers pour la recherche médicale de Fonds de recherche médicale Nelson Helen à la Fondation communautaire du Grand Kansas City.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cellgro | 10-013-CV | |
| Glutamax-I (stablized glutamine) | Life Technologies | 35050-079 | |
| Fetal Bovine Serum | SAFC | 12176C | |
| FuGENE6 transfection reagent | Promega | E2312 | |
| Hygromycin B, sterile in PBS | AG Scientific | H-1012-PBS | |
| pcDNA5/FRT vector | Life Technologies | V6010-20 | |
| Flp-In HEK293 cells | Life Technologies | R780-07 | |
| pOG44 Flp-Recombinase Expression Vector | Life Technologies | V600520 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | F2426 | |
| calf serum | SAFC | 12138C | |
| TARGETplus SMARTsiRNA pool | Dharmacon / Thermo Scientific | various | |
| 5x siRNA resuspension buffer | Dharmacon / Thermo Scientific | #B-002000-UB-100 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Life Technologies | 51985-091 | |
| PBS | Cellgro | 45000 | VWR |
| TrypLE (trypsin) | Life Technologies | 12604 | |
| 1x FLAG Peptide | Sigma | F3290 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Column | Bio-Rad | 737-5021 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO) | Amicon | UFC805024 | Fisher Scientific |
| Zeba Desalting Columns | Thermo Scientific | 89882 | |
| Anti-FLAG M2 antibody, mouse | Sigma | F3165 | |
| Anti-FLAG M2 antibody, rabbit | Sigma | F7425 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | |
| benzonase | Novagen | 70664 | |
| Equipment | Company | ||
| Wheaton Dounce Tissue Grinders | Wheaton | 06-435C | |
| JS-4.2 rotor in a J6 centrifuge | Beckman-Coulter | 339080 | |
| JA-17 rotor | Beckman-Coulter | 369691 | |
| 10 ml polycarbonate tubes | Beckman-Coulter | 355630 | |
| 70 ml polycarbonate bottles | Beckman-Coulter | 355655 | |
| Type 45 Ti rotor | Beckman-Coulter | 339160 | |
| Type 70.1 Ti rotor | Beckman-Coulter | 342184 | |
| BD Clay Adams Nutator Mixer | BD Diagnostics | 15172-203 | VWR |
| Glas-Col Tube/Vial Rotator | Glas-Col | 099A RD4512 | |
| PCR thermal cycler PTC 200 | MJ Research | PTC 200 | |
| roller bottle incubator | Bellco biotechnology | 353348 | |
| Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4 | Millipore | IPFL07810 | |
| lubricated 1.5ml microcentrifuge tubes | Costar | 3207 |
Riferimenti
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- Szerlong, H., Hinada, K., Viswanathan, R., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Cairns, B. R. The HSA domain binds nuclear actin-related proteins to regulate chromatin-remodeling ATPases. Nature Struct. Mol. Biol. 15 (5), 469-476 (2008).
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