In Vitro Pancreas Organogenese van Dispersed muis embryonale Progenitors

Summary

De driedimensionale cultuur methode beschreven in dit protocol recapituleert pancreas ontwikkeling van verspreide embryonale muis alvleesklier progenitoren, waaronder hun grote expansie, differentiatie en morfogenese in een vertakte orgaan. Deze methode is vatbaar voor beeldvorming, functiestoringen en manipulatie van de niche.

Abstract

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells ¹. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development ^2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens.

We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas.

We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell´s tensegrity.

Introduction

Orgelcultuur biedt een bruikbaar model dat de kloof tussen het complex, maar zeer relevante in-vivo-onderzoek en de handige maar bij benadering simulatie van cellijn modellen overbrugt. Bij de pancreas, is er geen cellijn volkomen gelijkwaardig pancreas voorlopercellen hoewel er getransformeerde cellijnen simuleren endocriene en exocriene cellen. De volwassen gehele alvleesklier kan niet worden gekweekt; endocriene geïsoleerde eilandjes kunnen worden gehandhaafd gedurende enkele weken zonder celproliferatie en weefselplakken kan in vitro worden gedurende enkele uren ^5. Embryonale pancreas cultuur is op grote schaal gebruikt niet alleen om de ontwikkeling ervan te bestuderen, maar ook om epitheliale-mesenchymale interacties ^4,6,7 onderzoeken, op de foto verwerkt ⁸ of chemisch bemoeien met hen ^9. Twee orgelcultuur methoden worden voornamelijk gebruikt: de eerste bestaat uit het kweken van alvleesklier knoppen op fibronectine gecoate platen ^2, dat is Convenient voor grafische doeleinden; de tweede optie is om de cultuur van de organen filters bij de lucht-water grensvlak ^3,4 die het beste bewaart morfogenese. Hoewel nuttig, deze methoden leiden tot een zekere mate van afvlakking; de uitbreiding van voorlopercellen is zeer beperkt in vergelijking met de normale ontwikkeling en uitgangspopulatie complex omvattende alle typen pancreatische cellen en mesenchymale cellen.

De mogelijkheid om de cultuur en uitbreiden verspreide primaire cellen is waardevol voor lineage relaties bestuderen en ontdekken de intrinsieke eigenschappen van geïsoleerde celtypen ^10. Sugiyama et al.. ¹¹ kon pancreas voorlopercellen en endocriene voorouders dat een aantal functionele tekens bewaard gedurende 3-5 dagen in cultuur op de feeder lagen behouden. Pancreatospheres, verwant aan neurospheres ¹² en mammospheres ^13, zijn uitgebreid van volwassen eilandjes en ductale cellen, hoewel de aard van de voorlopers / stamcellendat deze sferen te genereren is niet duidelijk. Bovendien, in tegenstelling fysiologische ontwikkeling, de pancreatospheres bevatte neuronen ^14,15. Bollen werden onlangs ook uit embryonale pancreas voorlopercellen ^16,17 en regenererende pancreata ¹⁸ met goede voorlopercellen expansie en de daaropvolgende differentiatie, maar niet om morfogenese recapituleren.

3D-modellen van verspreide en vaak gedefinieerd cellen die zichzelf organiseren in geminiaturiseerde organen onlangs bloeide en simuleren van de ontwikkeling of volwassene omzet van meerdere organen zoals de darm ^19,20, de maag ^21, lever ^22, de prostaat ²³ en de luchtpijp ^24. In sommige gevallen zijn ontwikkelings morfogenese en differentiatie zijn samengevat in 3D van ES-cellen, zoals bij optische koppen ^{25, 26} darm of de hersenen ^27.

Hier hebben we desCribe een methode om gedissocieerde multipotente pancreas voorlopercellen uit te breiden in een 3D Matrigel steiger waar ze kunnen differentiëren en zichzelf te organiseren.

Protocol

Dit protocol heeft als doel om te groeien pancreas organoids afgeleid van muizen E10.5 gedissocieerde epitheliale cellen de alvleesklier. Het protocol vereist ethische goedkeuring voor dierproeven. 1. Dissectie van Dorsale Alvleesklierkanker Bud uit E10.5 muizenembryo's Sacrifice getimed-zwangere muizen op embryonale dag (E) 10.5, opent de buik met een schaar, verwijder de twee baarmoederhoorns en leg ze in een schotel van 10 cm Petri gevuld met ko…

Representative Results

E10.5 dorsale pancreas voorlopercellen los en gezaaid in 3D Matrigel recapituleren ontwikkeling van de pancreas. Voorouders kan heel eenvoudig worden gevolgd met fluorescerende verslaggevers. In ons geval gebruikten we een transgene muis die een nucleaire GFP-eiwit gecontroleerd door Pdx1 promotor (Pdx1-Ngn3-ER TM-nGFP) (Film 1) in de afwezigheid van tamoxifen en dus zonder activering Neurog3 4 (figuur 2) uitdrukt. Met het organoïde m…

Discussion

Grootschalige productie van functionele beta-cellen in vitro nog ineffectief ^1. In deze uitdagende context kan ontwikkelingsbiologie studies helpen ontcijferen exacte signalen die vereist zijn voor de differentiatie van functionele beta-cellen. Dit protocol maakt het onderhoud, groei en differentiatie van embryonale pancreatische voorlopercellen in vitro. Dit omvat de vorming van insuline producerende beta-cellen die geen co-expressie andere endocriene hormonen, hebben hoge niveaus van Pdx1,…

Materials

Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063	Stock keept at -20°C
KnockOut Serum replacement (supplement)	Gibco	10828-028	Stock keept at -20°C
2-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	3148-25ML	Stock keept at 4°C
Phorbol Myristate Acetate (PMA)	Calbiotech	524400-1MG	Stock keept at -20°C
Y-27632 (ROCK inhibitor)	Sigma Aldrich	ab120129	Stock keept at -20°C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems
EGF	Sigma Aldrich	E9644-2MG	Stock keept at -80°C
Recombinant Human R-spondin 1	R&D	4645-RS-025/CF	Stock keept at -80°C
- or -
Recombinant Mouse R-spondin 1	R&D	3474-RS-050	Stock keept at -80°C
Recombinant Human FGF1 (aFGF)	R&D	232-FA-025	Stock keept at -80°C- do not include to increase beta cell production
Heparin (Liquemin)	Drossapharm		Stock keept at 4°C
Recombinant Human FGF10	R&D	345-FG-025	Stock keept at -80°C
DMEM/F-12	Gibco	21331-020
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063	Stock keept at -20°C
B27 x50 (supplement)	Gibco	17504-044	Stock keept at -20°C
Recombinant Human FGF2 (bFGF)	R&D	233-FB-025	Stock keept at -80°C
Y-27632 (ROCK inhibitor)	Sigma Aldrich	ab120129	Stock keept at -20°C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems
DMEM/F-12	Gibco	21331-020
Matrigel	Corning	356231	Stock keept at -20°C
Trypsin 0.05%	Gibco	25300-054	Stock keept at 4°C
RNAlater – RNA stabilizing reagent	Qiagen	76104	Store at room temperature
Dispase	Sigma Aldrich	D4818-2MG	Stock keept at -20°C
BSA for reconstitution	Milipore	81-068	For reconstituition of cytokines  – Stock keept at -20°C
Fetal calf serum (FCS)	Gibco	16141079	Stock keept at -20°C
60 well MicroWell trays	Sigma Aldrich	M0815-100EA
4-well plates	Thermo Scientific	176740
95-well plates F bottom	Greiner Bio	6555180
Glas bottom plates	Ibidi	81158
Disposal micropittes	Blaubrand	708745