In Vitro pancréas organogenèse du dispersées progéniteurs embryonnaires de souris

Summary

Le procédé de culture en trois dimensions décrite dans ce protocole récapitule le développement du pancréas de progéniteurs embryonnaires dispersées de pancréas de souris, y compris leur expansion substantielle, la morphogenèse et la différenciation dans un organe ramifié. Ce procédé se prête à l'imagerie, la perturbation fonctionnelle et la manipulation de la niche.

Abstract

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells ¹. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development ^2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens.

We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas.

We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell´s tensegrity.

Introduction

culture d'organes constitue un modèle utile qui comble le fossé entre le complexe mais très pertinente dans les enquêtes in vivo et la simulation pratique mais approximative de modèles de lignées cellulaires. Dans le cas du pancréas, il n'y a pas de ligne parfaitement équivalente à progéniteurs pancréatiques bien qu'il existe des lignées cellulaires transformées simulant des cellules endocrines et exocrines cellule. L'adulte pancréas entier ne peut pas être cultivé; îlots endocrines isolées peuvent être maintenus pendant quelques semaines sans prolifération cellulaire et des tranches de tissu peuvent être conservées in vitro pendant ⁵ quelques heures. Culture de pancréas embryonnaire a été largement utilisé non seulement pour étudier son développement, mais aussi pour étudier les interactions épithéliales-mésenchymateuses ^4,6,7, à l'image des processus ⁸ ou interférer chimiquement avec eux ^9. Deux méthodes de culture d'organes sont principalement utilisés: la première consiste à cultiver des bourgeons pancréatiques sur la fibronectine plaques enduites de ^2, ce qui est convenient à des fins d'imagerie; la deuxième option est la culture des organes sur les filtres à l'interface air-liquide qui préserve mieux ^3,4 morphogenèse. Bien que très utiles, ces procédés conduisent à un certain degré d'aplatissement; l'expansion des progéniteurs est très limité par rapport au développement normal et à la population de départ est complexe comprenant tous les types de cellules pancréatiques et des cellules mésenchymateuses.

La capacité de la culture et de développer des cellules primaires dispersées est précieux pour étudier les relations de lignage et de découvrir les propriétés intrinsèques des types de cellules isolées ^10. Sugiyama et al. ¹¹ pourrait maintenir les progéniteurs du pancréas et des progéniteurs endocrines qui ont conservé certains caractères fonctionnels pour 3-5 jours de culture sur des couches nourricières. Pancreatospheres, semblables à neurosphères ¹² et mammospheres ^13, ont été élargies de îlots adultes et les cellules canalaires bien que la nature des progéniteurs / cellules souchesqui génèrent ces sphères n'est pas claire. De plus, en contraste avec le développement physiologique, les pancreatospheres contenaient certains neurones ^14,15. Sphères ont été récemment produites à partir de progéniteurs pancréatiques embryonnaires ^16,17 et régénération pancréas ¹⁸ avec une bonne extension des progéniteurs et la différenciation ultérieure, mais n'ont pas réussi à récapituler la morphogenèse.

Des modèles 3D à partir de cellules dispersées et souvent définis que l'auto-organisent dans les organes miniaturisés ont récemment fleuri et simuler le développement ou adulte chiffre d'affaires de plusieurs organes tels que l'intestin ^19,20, l'estomac ^21, le foie ^22, la prostate ²³ et la trachée ^24. Dans certains cas, la morphogenèse et la différenciation de développement ont été récapitulé en 3D à partir de cellules ES, comme c'est le cas de coupes optiques ^25, de l'intestin ou du cerveau ^{26 27.}

Ici, nous avons desCribe un moyen d'étendre progéniteurs pancréatiques multipotentes dissociées dans un échafaudage 3D Matrigel où ils peuvent se différencier et s'auto-organiser.

Protocol

Ce protocole a pour but de développer organites pancréatiques murines dérivées de E10.5 dissociées des cellules épithéliales pancréatiques. Le protocole exige l'approbation éthique pour l'expérimentation animale. 1. Dissection de Dorsale pancréatique Bud de E10.5 embryons de souris Moyen essentiel sacrifier souris expiré enceintes à jour embryonnaire (E) 10.5, ouvrez l'abdomen avec une paire de ciseaux, enlever les deux cornes …

Representative Results

E10.5 dorsales progéniteurs pancréatiques dissociées et ensemencées en 3D Matrigel récapitulent le développement du pancréas. Progéniteurs peuvent être le plus facilement suivies avec les journalistes fluorescentes. Dans notre cas nous avons utilisé une souris transgénique qui exprime une protéine GFP nucléaire contrôlée par Pdx1 promoteur (Pdx1-Ngn3-ER TM-NGFP) (Film 1) en l'absence de tamoxifène et donc sans activation Neurog3 4 (figure 2). <…

Discussion

La production à grande échelle de cellules bêta fonctionnelles in vitro est encore inefficace ^1. Dans ce contexte difficile, les études de biologie du développement peuvent aider à déchiffrer les signaux exactes qui sont nécessaires à la différenciation des cellules bêta fonctionnelles. Ce protocole permet le maintien, l'expansion et la différenciation des progéniteurs pancréatiques embryonnaires in vitro. Cela comprend la formation des cellules bêta productrices d'ins…

Materials

Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063	Stock keept at -20°C
KnockOut Serum replacement (supplement)	Gibco	10828-028	Stock keept at -20°C
2-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	3148-25ML	Stock keept at 4°C
Phorbol Myristate Acetate (PMA)	Calbiotech	524400-1MG	Stock keept at -20°C
Y-27632 (ROCK inhibitor)	Sigma Aldrich	ab120129	Stock keept at -20°C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems
EGF	Sigma Aldrich	E9644-2MG	Stock keept at -80°C
Recombinant Human R-spondin 1	R&D	4645-RS-025/CF	Stock keept at -80°C
- or -
Recombinant Mouse R-spondin 1	R&D	3474-RS-050	Stock keept at -80°C
Recombinant Human FGF1 (aFGF)	R&D	232-FA-025	Stock keept at -80°C- do not include to increase beta cell production
Heparin (Liquemin)	Drossapharm		Stock keept at 4°C
Recombinant Human FGF10	R&D	345-FG-025	Stock keept at -80°C
DMEM/F-12	Gibco	21331-020
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063	Stock keept at -20°C
B27 x50 (supplement)	Gibco	17504-044	Stock keept at -20°C
Recombinant Human FGF2 (bFGF)	R&D	233-FB-025	Stock keept at -80°C
Y-27632 (ROCK inhibitor)	Sigma Aldrich	ab120129	Stock keept at -20°C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems
DMEM/F-12	Gibco	21331-020
Matrigel	Corning	356231	Stock keept at -20°C
Trypsin 0.05%	Gibco	25300-054	Stock keept at 4°C
RNAlater – RNA stabilizing reagent	Qiagen	76104	Store at room temperature
Dispase	Sigma Aldrich	D4818-2MG	Stock keept at -20°C
BSA for reconstitution	Milipore	81-068	For reconstituition of cytokines  – Stock keept at -20°C
Fetal calf serum (FCS)	Gibco	16141079	Stock keept at -20°C
60 well MicroWell trays	Sigma Aldrich	M0815-100EA
4-well plates	Thermo Scientific	176740
95-well plates F bottom	Greiner Bio	6555180
Glas bottom plates	Ibidi	81158
Disposal micropittes	Blaubrand	708745