Il metodo di coltura tridimensionale descritto in questo protocollo ricapitola sviluppo pancreas dispersi da progenitori topo pancreas embrionali, compresa la loro notevole espansione, differenziazione e morfogenesi in un organo ramificato. Questo metodo è suscettibile di immagini, interferenze funzionali e manipolazione della nicchia.
The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells 1. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development 2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens.
We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas.
We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell´s tensegrity.
Cultura Organ fornisce un modello utile che colma il divario tra il complesso, ma di grande rilevanza nelle indagini vivo e conveniente, ma approssimativa simulazione di modelli di linee cellulari. Nel caso del pancreas, non vi è alcuna linea cellulare perfettamente equivalente a progenitori pancreas anche se ci si trasformano linee cellulari che simulano cellule endocrine ed esocrine. L'intero pancreas adulto non può essere coltivato; isolato isolotti endocrini possono essere mantenuti per poche settimane senza proliferazione cellulare e fette di tessuto possono essere tenuti in vitro per alcune ore 5. Cultura pancreas embrionale è stato ampiamente utilizzato non solo per studiare il suo sviluppo, ma anche per indagare interazioni epitelio-mesenchimale 4,6,7, all'immagine processi 8 o interferire chimicamente con essi 9. Due organi metodi di coltura sono utilizzati principalmente: la prima consiste nella coltura gemme pancreatiche su piastre rivestite di fibronectina 2, che è conveutile per gli scopi di imaging; la seconda opzione è quella di cultura organi sui filtri all'interfaccia aria-liquido 3,4 che meglio conserva morfogenesi. Sebbene molto utile, questi metodi portano ad un certo grado di appiattimento; l'espansione di progenitori è molto limitato rispetto al normale sviluppo e la popolazione di partenza è complesso comprendente tutti i tipi di cellule pancreatiche e cellule mesenchimali.
La capacità di cultura ed espandere cellule primarie disperse è prezioso per studiare le relazioni lignaggio e scoprire le proprietà intrinseche dei tipi di cellule isolate 10. Sugiyama et al 11. Potrebbe mantenere progenitori pancreas e progenitori endocrini che hanno conservato alcuni caratteri funzionali per 3-5 giorni di coltura su livelli di alimentazione. Pancreatospheres, simile a neurospheres 12 e mammospheres 13, sono stati espansi da isolotti adulte e cellule duttali sebbene la natura dei progenitori / cellule staminaliche generano queste sfere non è chiaro. Inoltre, in contrasto con sviluppo fisiologico, i pancreatospheres contenevano alcuni neuroni 14,15. Spheres sono stati recentemente realizzati da progenitori pancreas embrionale 16,17 e rigenerante pancreas 18 con buona espansione progenitrici e la successiva differenziazione, ma non è riuscito a riepilogare morfogenesi.
Modelli 3D da cellule disperse e spesso definiti che l'auto-organizzano in organi miniaturizzati hanno recentemente fiorito e simulare lo sviluppo o adulto fatturato di più organi quali l'intestino 19,20, 21 stomaco, il fegato 22, la prostata 23 e la trachea 24. In alcuni casi, la morfogenesi di sviluppo e differenziazione sono stati riassunti in 3D da cellule ES, come è il caso di tazze ottiche 25, 26 o intestino cerebrali 27.
Qui, desCRIBE un metodo per espandere dissociate progenitori pancreatici multipotenti in un ponteggio 3D Matrigel dove possono differenziarsi e di auto-organizzarsi.
La produzione su larga scala delle cellule beta funzionali in vitro è ancora inefficace 1. In questo contesto impegnativo, studi di biologia dello sviluppo possono aiutare decifrare i segnali esatti che sono necessari per la differenziazione delle cellule beta funzionali. Questo protocollo consente per la manutenzione, l'espansione e la differenziazione di progenitori pancreatici embrionali in vitro. Ciò include la formazione di cellule beta produttrici di insulina che non co-express a…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato finanziato in sequenza da un PRN Frontiere della genetica premio pilota, Juvenile Diabetes Research Foundation Grant e Grant 41-2009-775 12-126875 da Det Frie forskningsråd / Sundhed og Sygdom. Gli autori ringraziano il laboratorio Spagnoli per ospitare le riprese video.
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | Stock keept at -20°C | |
KnockOut Serum replacement (supplement) | Gibco | 10828-028 | Stock keept at -20°C | |
2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 3148-25ML | Stock keept at 4°C | |
Phorbol Myristate Acetate (PMA) | Calbiotech | 524400-1MG | Stock keept at -20°C | |
Y-27632 (ROCK inhibitor) | Sigma Aldrich | ab120129 | Stock keept at -20°C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems | |
EGF | Sigma Aldrich | E9644-2MG | Stock keept at -80°C | |
Recombinant Human R-spondin 1 | R&D | 4645-RS-025/CF | Stock keept at -80°C | |
- or - | ||||
Recombinant Mouse R-spondin 1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock keept at -80°C | |
Recombinant Human FGF1 (aFGF) | R&D | 232-FA-025 | Stock keept at -80°C- do not include to increase beta cell production | |
Heparin (Liquemin) | Drossapharm | Stock keept at 4°C | ||
Recombinant Human FGF10 | R&D | 345-FG-025 | Stock keept at -80°C | |
DMEM/F-12 | Gibco | 21331-020 | ||
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | Stock keept at -20°C | |
B27 x50 (supplement) | Gibco | 17504-044 | Stock keept at -20°C | |
Recombinant Human FGF2 (bFGF) | R&D | 233-FB-025 | Stock keept at -80°C | |
Y-27632 (ROCK inhibitor) | Sigma Aldrich | ab120129 | Stock keept at -20°C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems | |
DMEM/F-12 | Gibco | 21331-020 | ||
Matrigel | Corning | 356231 | Stock keept at -20°C | |
Trypsin 0.05% | Gibco | 25300-054 | Stock keept at 4°C | |
RNAlater – RNA stabilizing reagent | Qiagen | 76104 | Store at room temperature | |
Dispase | Sigma Aldrich | D4818-2MG | Stock keept at -20°C | |
BSA for reconstitution | Milipore | 81-068 | For reconstituition of cytokines – Stock keept at -20°C | |
Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 16141079 | Stock keept at -20°C | |
60 well MicroWell trays | Sigma Aldrich | M0815-100EA | ||
4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | ||
95-well plates F bottom | Greiner Bio | 6555180 | ||
Glas bottom plates | Ibidi | 81158 | ||
Disposal micropittes | Blaubrand | 708745 |