이 프로토콜에 기재된 삼차원 배양법 분지 기관에 자신의 상당한 팽창, 분화 및 형태 발생을 포함한 분산 배아 마우스 췌장 전구 세포로부터 췌장 개발 되풀이되었습니다. 이 방법은 영상, 틈새 시장의 기능 장애 및 조작에 대한 의무입니다.
The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells 1. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development 2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens.
We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas.
We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell´s tensegrity.
장기 문화는 생체 내 연구에서 복잡하지만 관련성이 높은 사이의 간격 및 세포 라인 모델의 편리하지만 대략적인 시뮬레이션을 다리에 유용한 모델을 제공합니다. 췌장의 경우, 내분비와 외분비 세포 시뮬레이션 세포주가 변형 되더라도 췌장 전구 세포로 완전히 동등한 어떠한 세포주도 없다. 성인 전체 췌장을 배양 할 수 없습니다; 절연 내분비 아일렛 세포 증식없이 몇 주 동안 유지 될 수 있으며, 조직 조각은 몇 시간에서 5 시험 관내에서 유지 될 수있다. 배아의 췌장 문화가 널리 개발을 연구뿐만 아니라 사용되었습니다뿐만 아니라 8을 처리하는 이미지로, 상피 – 간엽 상호 작용 4,6,7을 조사하기 위해 화학적으로 그 9 방해 할 수 있습니다. 두 기관 배양 방법이 주로 사용된다 : 첫 번째는 conve입니다 피브로넥틴 코팅 플레이트 2에 췌장 꽃 봉오리를 배양에 구성촬상 목적 더욱 편리 할; 두 번째 옵션은 문화에 가장 형태 형성을 유지 공기 – 액체 인터페이스 3,4에서 필터에 대한 기관입니다. 매우 유용하지만, 이러한 방법은 평탄화의 어느 정도 이어질; 정상적인 발달에 비해 시작 인구가 췌장 세포 및 중간 엽 세포의 모든 유형을 포함하는 복잡한 같이 선조의 팽창은 매우 제한된다.
문화 능력과 분산 일차 전지를 확장 계보 관계를 연구하고 고립 된 세포 유형 (10)의 고유 특성을 발견 할 가치가있다. 스기야마 등. 11 췌장 전구 세포 및 피더 레이어에 문화에 3 ~ 5 일 일부 기능 문자를 유지 내분비 전구 세포를 유지할 수 있습니다. 조상의 자연 / 줄기 세포하지만 neurosphere를 12, 13 mammospheres에 가깝다 Pancreatospheres는 성인 독도 및 유관 세포에서 확장되었습니다이러한 분야를 생성하는 것은 명확하지 않다. 또, 생리 현상과는 대조적으로, pancreatospheres 일부 뉴런에게 14,15을 함유 하였다. 분야는 최근 배아 췌장 전구 세포 (16, 17)과 좋은 시조 확장 이후의 분화와 pancreata 18 재생에서 생산하지만, 형태 형성을 요점을 되풀이하는 데 실패했다.
소형 기관에 자체 조직으로 분산 종종 정의 세포에서 3D 모델은 최근 번성하고 소장 (19, 20), 배 (21), 간 (22), 전립선 (23)과 기관 등의 여러 장기의 개발 또는 성인 매출을 시뮬레이션 한 24. 광섬유 컵 25, 26 또는 뇌 부위 (27)의 경우와 같이 몇몇 경우에, 형태 형성 발달과 분화는, ES 세포로부터 3D로 효과적으로 요약되었다.
여기, 우리 DES그들은 차별화 자체 구성 할 수 있습니다 3D 리겔 비계에서 해리 다 능성 췌장 전구 세포를 확장하는 방법을 cribe.
시험 관내에서 기능적인 베타 세포의 대규모 생산은 여전히 하나 비효율적이다. 이 도전적인 상황에서, 발달 생물학 연구 기능의 베타 세포의 분화에 필요한 정확한 신호를 해독하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 체외에서 배아의 췌장 전구 세포의 유지 보수, 확장과 차별화 할 수 있습니다. 이것은 다른 내분비 호르몬을 공동으로 표현하지 않는 인슐린을 생산?…
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 Det에 FRIE Forskningsråd / Sundhed OG Sygdom에서 유전학 파일럿 상에 NCCR 프론티어, 청소년 당뇨병 연구 재단의 41-2009-775 그랜트 12-126875 순차적으로 투자되었다. 저자는 비디오 촬영을 호스팅 스파 놀리 실험실 감사합니다.
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | Stock keept at -20°C | |
KnockOut Serum replacement (supplement) | Gibco | 10828-028 | Stock keept at -20°C | |
2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 3148-25ML | Stock keept at 4°C | |
Phorbol Myristate Acetate (PMA) | Calbiotech | 524400-1MG | Stock keept at -20°C | |
Y-27632 (ROCK inhibitor) | Sigma Aldrich | ab120129 | Stock keept at -20°C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems | |
EGF | Sigma Aldrich | E9644-2MG | Stock keept at -80°C | |
Recombinant Human R-spondin 1 | R&D | 4645-RS-025/CF | Stock keept at -80°C | |
- or - | ||||
Recombinant Mouse R-spondin 1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock keept at -80°C | |
Recombinant Human FGF1 (aFGF) | R&D | 232-FA-025 | Stock keept at -80°C- do not include to increase beta cell production | |
Heparin (Liquemin) | Drossapharm | Stock keept at 4°C | ||
Recombinant Human FGF10 | R&D | 345-FG-025 | Stock keept at -80°C | |
DMEM/F-12 | Gibco | 21331-020 | ||
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | Stock keept at -20°C | |
B27 x50 (supplement) | Gibco | 17504-044 | Stock keept at -20°C | |
Recombinant Human FGF2 (bFGF) | R&D | 233-FB-025 | Stock keept at -80°C | |
Y-27632 (ROCK inhibitor) | Sigma Aldrich | ab120129 | Stock keept at -20°C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems | |
DMEM/F-12 | Gibco | 21331-020 | ||
Matrigel | Corning | 356231 | Stock keept at -20°C | |
Trypsin 0.05% | Gibco | 25300-054 | Stock keept at 4°C | |
RNAlater – RNA stabilizing reagent | Qiagen | 76104 | Store at room temperature | |
Dispase | Sigma Aldrich | D4818-2MG | Stock keept at -20°C | |
BSA for reconstitution | Milipore | 81-068 | For reconstituition of cytokines – Stock keept at -20°C | |
Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 16141079 | Stock keept at -20°C | |
60 well MicroWell trays | Sigma Aldrich | M0815-100EA | ||
4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | ||
95-well plates F bottom | Greiner Bio | 6555180 | ||
Glas bottom plates | Ibidi | 81158 | ||
Disposal micropittes | Blaubrand | 708745 |