एक उपन्यास<em> में विवो</em> जीन स्थानांतरण तकनीक और<em> इन विट्रो</emMusculoskeletal विकारों में हड्डी हानि के अध्ययन के लिए> सेल आधारित assays
Summary
Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.
Abstract
Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.
Introduction
Musculoskeletal रोगों राष्ट्रीय और स्थानीय स्वास्थ्य प्रणाली 1 के लिए संयुक्त राज्य अमेरिका और वर्तमान गंभीर परिणाम में लाखों लोगों को प्रभावित करते हैं. इन विकारों की हड्डी का नुकसान और व्यापक उपचार और वसूली की लंबी अवधि की आवश्यकता है कि संयुक्त समारोह की विशेषता है. आमतौर पर, osteoclasts की संख्या और / या गतिविधि में एक रिश्तेदार वृद्धि, कोशिकाओं ऑस्टियोपोरोसिस में, हड्डी resorb के लिए विशेष और गठिया 2 मनाया जाता है. शारीरिक शर्तों के तहत osteoclasts की संख्या और गतिविधि अस्थिकोरक द्वारा निर्मित है जो परमाणु कारक κ बी ligand (RANKL), के रिसेप्टर उत्प्रेरक द्वारा नियंत्रित किया जाता है. Osteoprotegerin (OPG), RANKL के लिए एक प्रलोभन रिसेप्टर भी अस्थिकोरक 3 द्वारा निर्मित है प्रणालीगत sRANKL की overexpression, या OPG का विलोपन शामिल है में vivo पशु मॉडल ऑस्टियोपोरोसिस अनुसंधान में बहुत कीमती हैं.; हालांकि, इन तरीकों ट्रांसजेनिक चूहों 4,5 की पीढ़ी की आवश्यकता होती है. इधर, एक उपन्यास विकल्पmusculoskeletal संबंधी विकारों के अध्ययन के लिए sRANKL overexpressing की विधि का वर्णन किया है. विशेष रूप से, minicircle (एमसी) डीएनए प्रौद्योगिकी और hydrodynamic प्रसव के तरीके विवो में sRANKL का जीन स्थानांतरण प्राप्त करने और प्रणालीबद्ध 6 माउस sRANKL overexpress करने के लिए इस्तेमाल किया गया.
इस विधि को भी इस तरह के कम कैल्शियम आहार 8 से ovariectomy 7 और पथ्य हस्तक्षेप के बाद osteoclasts के हार्मोनल मॉडुलन के रूप में ऑस्टियोपोरोसिस के अन्य vivo मॉडल, के लिए पूरक है. इन मॉडलों वे शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है और एक महत्वपूर्ण लागत 9 पर कई महीनों तक का समय लग सकता है लेकिन musculoskeletal संबंधी विकारों के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए बहुत उपयोगी हैं. Ovariectomized (OVX) कृंतक मॉडल अंडाशय के हटाने जिससे मानव postmenopausal ऑस्टियोपोरोसिस 10 नकल उतार एस्ट्रोजन की कमी की ओर जाता है, जहां एक प्रयोगात्मक पशु मॉडल है. मानव रजोनिवृत्ति के बाद ऑस्टियोपोरोसिस, जहां एस्ट्रोजन defici एक शर्तency अस्थि भंग का खतरा बढ़ जाता है और ऑस्टियोपोरोसिस संयुक्त राज्य अमेरिका अकेले में लगभग आठ लाख महिलाओं को प्रभावित करता है. OVX मॉडल रजोनिवृत्ति के बाद ऑस्टियोपोरोसिस के लिए उपयोगी है हालांकि यह सामान्य रूप में ऑस्टियोपोरोसिस का अध्ययन करने में सीमित लाभ प्रदान करता है. एस्ट्रोजन इसलिए इसके अभाव में एक वृद्धि अस्थिशोषक गतिविधि 10-12 मनाया जाता है, अस्थिशोषक उत्प्रेरण और अस्थिकोरक apoptosis बाधा, हड्डी नुकसान को रोकता है. अस्थि अवशोषण के पक्ष में है कि एक RANKL-OPG अनुपात असंतुलन भी 13 मनाया जाता है. वृद्धि कारक β (TGF β), वृद्धि हुई इंटरल्यूकिन 7 (आईएल -7) और TNF, आईएल -1 और आईएल -6 14,15 बदलने के कम स्तर से हालांकि, विवो में एस्ट्रोजन की कमी भी साथ है. इन साइटोकिन्स RANKL मार्ग की हड्डी remodeling modulatory कार्यों स्वतंत्र जाना जाता है, यह केवल RANKL दर्जा अक्ष के लिए किसी भी अस्थिशोषक सक्रियण विशेषता के लिए असंभव है. इस पत्र में वर्णित मॉडल विव में अध्ययन करने के लिए सक्षम बनाता है शोधकर्ताओंओ समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स बिना osteoclastogenesis और हड्डी हानि में RANKL दर्जा अक्ष OVX कृंतक मॉडल की तुलना में.
साथ ही, इन विट्रो osteoclastogenesis तकनीक musculoskeletal रोगों के संभावित चिकित्सीय उपचार के लिए अस्थिशोषक सक्रियण अध्ययन करने के लिए आवश्यक उपकरण हैं. पिछले अध्ययनों से भी माउस बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी उत्तेजक कारक (एम सीएसएफ) और माउस sRANKL साथ माउस अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज (BMMs) संवर्धन अस्थिशोषक भेदभाव 3,16,17 का कारण बन सकता है दिखाया है. इधर, माउस अस्थि मज्जा से और साथ ही इन विट्रो 18 में मानव परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं (PBMCs) से multinucleated अस्थिशोषक की तरह कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए प्रोटोकॉल में वर्णित हैं. एक परिपक्व टर्मिनली विभेदित और पूरी तरह कार्यात्मक अस्थिशोषक को परिभाषित करने के लिए आवश्यक सेल आधारित assays भी संक्षेप में वर्णन किया गया हैं. ये इन विट्रो तकनीक विवो दृष्टिकोण में उपन्यास के पूरक हैं और एक साथ पी के रूप में सेवाowerful खोजी उपकरण अस्थिशोषक भेदभाव और सक्रियण अध्ययन करने के लिए. इन पद्धतियों का प्रयोग, वैज्ञानिकों vivo में इन विट्रो में osteoclasts उत्पन्न करने और उनके प्रसार और क्रियान्वयन के लिए आवश्यक उत्तेजनाओं और संकेतों को परिभाषित करने के साथ ही औषधीय और जैविक inhibitors की प्रभावकारिता का परीक्षण करने में सक्षम हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
Musculoskeletal शर्तों रुग्णता और विकलांगता के कारणों का नेतृत्व कर रहे हैं और 150 से अधिक बीमारियों और syndromes के शामिल हैं, आज लगभग 90 लाख अमेरिकियों को प्रभावित. संयुक्त सूजन और हड्डी विनाश गठिया और हड्डियों की कमजोर…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research was partly supported by NIH research grants R01 AR062173 and SHC 250862 to IEA. ES is the recipient of NIH T32 CTSC predoctoral fellowship.
Materials
| alpha-MEM | Life Technologies | 12561-056 | |
| Human M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-096-492 | |
| Mouse M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-094-643 | |
| Human RANK-Ligand – soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-631 | |
| Mouse RANK-Ligand – soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-076 | |
| Tailveiner Restrainer for mice | Braintree | TV-150 STD | |
| Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit | R&D systems | MTR00 | |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma | 387A | |
| MouseTRAP assay | immunodiagnostic systems | SB-TR103 |
Riferimenti
- Yelin, E. Cost of musculoskeletal diseases: impact of work disability and functional decline. The Journal of rheumatology. Supplement. 68, 8-11 (2003).
- Boyce, B. F., Rosenberg, E., de Papp, A. E., Duong le, T. The osteoclast, bone remodelling and treatment of metabolic bone disease. European journal of clinical investigation. 42, 1332-1341 (2012).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, 165-176 (1998).
- Mizuno, A., et al. Transgenic mice overexpressing soluble osteoclast differentiation factor (sODF) exhibit severe osteoporosis. Journal of bone and mineral metabolism. 20, 337-344 (2002).
- Bucay, N., et al. osteoprotegerin-deficient mice develop early onset osteoporosis and arterial calcification. Gene., & development. 12, 1260-1268 (1998).
- Suda, T., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 15, 2063-2069 (2007).
- Wronski, T. J., Dann, L. M., Scott, K. S., Cintron, M. Long-term effects of ovariectomy and aging on the rat skeleton. Calcified tissue international. 45, 360-366 (1989).
- Seto, H., Aoki, K., Kasugai, S., Ohya, K. Trabecular bone turnover, bone marrow cell development, and gene expression of bone matrix proteins after low calcium feeding in rats. Bone. 25, 687-695 (1999).
- Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research. Comparative medicine. 58, 424-430 (2008).
- Sherman, B. M., West, J. H., Korenman, S. G. The menopausal transition: analysis of LH, FSH, estradiol, and progesterone concentrations during menstrual cycles of older women. The Journal of clinical endocrinology and metabolism. 42, 629-636 (1976).
- Hughes, D. E., et al. Estrogen promotes apoptosis of murine osteoclasts mediated by TGF-beta. Nature medicine. 2, 1132-1136 (1996).
- Kousteni, S., et al. Nongenotropic, sex-nonspecific signaling through the estrogen or androgen receptors: dissociation from transcriptional activity. Cell. 104, 719-730 (2001).
- Ominsky, M. S., et al. RANKL inhibition with osteoprotegerin increases bone strength by improving cortical and trabecular bone architecture in ovariectomized rats. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 23, 672-682 (2008).
- Kitazawa, R., Kimble, R. B., Vannice, J. L., Kung, V. T., Pacifici, R. Interleukin-1 receptor antagonist and tumor necrosis factor binding protein decrease osteoclast formation and bone resorption in ovariectomized mice. The Journal of clinical investigation. 94, 2397-2406 (1994).
- Weitzmann, M. N., Pacifici, R. Estrogen deficiency and bone loss: an inflammatory tale. The Journal of clinical investigation. 116, 1186-1194 (2006).
- Suda, T., Nakamura, I., Jimi, E., Takahashi, N. Regulation of osteoclast function. J Bone Miner Res. 12, 869-879 (1997).
- Asagiri, M., Takayanagi, H. The molecular understanding of osteoclast differentiation. Bone. 40, 251-264 (2007).
- Matsuzaki, K., et al. Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cell cultures. Biochemical and biophysical research communications. 246, 199-204 (1998).
- Adamopoulos, I. E., et al. Synovial fluid macrophages are capable of osteoclast formation and resorption. The Journal of pathology. 208, 35-43 (2006).
- Adamopoulos, I. E., et al. Interleukin-17A upregulates receptor activator of NF-kappaB on osteoclast precursors. Arthritis researc., & therapy. 12, (2010).
- Jones, D., Glimcher, L. H., Aliprantis, A. O. Osteoimmunology at the nexus of arthritis, osteoporosis, cancer, and infection. J Clin Invest. 121, 2534-2542 (2011).
- Sato, K., Takayanagi, H. Osteoclasts, rheumatoid arthritis, and osteoimmunology. Curr Opin Rheumatol. 18, 419-426 (2006).
- Das, S., Crockett, J. C. Osteoporosis – a current view of pharmacological prevention and treatment. Drug design, development and therapy. 7, 435-448 (2013).
- Chen, Z. Y., He, C. Y., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 8, 495-500 (2003).
- Kay, M. A., He, C. Y., Chen, Z. Y. A robust system for production of minicircle DNA vectors. Nature biotechnology. 28, 1287-1289 (2010).
- Chen, Z. Y., He, C. Y., Kay, M. A. Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo. Human gene therapy. 16, 126-131 (2005).
- Halleen, J. M., et al. Tartrate-resistant acid phosphatase 5b: a novel serum marker of bone resorption. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 15, 1337-1345 (2000).
- Adamopoulos, I. E., et al. IL-23 is critical for induction of arthritis, osteoclast formation, and maintenance of bone mass. J Immunol. 187, 951-959 (2011).
- Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. Modulation of osteoclast differentiation. Endocrine reviews. 13, 66-80 (1992).
- Takahashi, N., et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology. 123, 2600-2602 (1988).
- Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).
- Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors. The Journal of experimental medicine. 190, 1741-1754 (1999).
- Fuller, K., et al. Macrophage colony-stimulating factor stimulates survival and chemotactic behavior in isolated osteoclasts. The Journal of experimental medicin. 178, 1733-1744 (1993).
- Edwards, J. R., Mundy, G. R. Advances in osteoclast biology: old findings and new insights from mouse models. Nature reviews. Rheumatology. 7, 235-243 (2011).
- Weinstein, R. S., et al. Promotion of osteoclast survival and antagonism of bisphosphonate-induced osteoclast apoptosis by glucocorticoids. The Journal of clinical investigation. 109, 1041-1048 (2002).
