Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.
Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.
Kas-iskelet sistemi hastalıkları, ulusal ve yerel sağlık sistemleri için 1 Amerika Birleşik Devletleri ve mevcut ciddi sonuçlara milyonlarca insanı etkiler. Bu bozukluklar arasında kemik kaybı ve geniş bir tedavi ve kurtarma uzun süre gerektiren eklem fonksiyonu ile karakterize edilir. Genellikle, osteoklastların sayısı ve / veya aktivitesinde bir nispi artış, hücre osteoporozda, kemik emmek için özel ve artrit 2 görülmektedir. Fizyolojik koşullar altında, osteoklastların sayısı ve etkinliği osteoblastlar tarafından üretilen nükleer faktör κ-B ligandının (RANKL) reseptör aktivatörü düzenlenir. Osteoprotegerin (OPG), RANKL için bir yem reseptörü de 3 osteoblastlar tarafından üretilen sistemik sRANKL aşın veya OPG silinmesini içerir in vivo hayvan modelleri, osteoporoz araştırmalarında, çok değerlidir.; Bununla birlikte, bu yöntemler, transgenik farelerin 4,5 üretilmesini gerektirir. Burada, yeni bir alternatifkas-iskelet sistemi ile ilgili hastalıkların çalışma için sRANKL aşırı ifade eden bir yöntem tarif edilmektedir. Özellikle, minicircle (MC) DNA teknolojisi ve hidrodinamik dağıtım yöntemler, canlı ortam içinde sRANKL arasında gen transferini elde etmek ve sistemik 6 fare sRANKL aşırı ifade etmek için kullanılmıştır.
Bu yöntem, aynı zamanda, düşük kalsiyum diyeti 8 ile ovariektomi 7 ve diyet müdahalesi şu osteoklast hormonal düzenlenmesi gibi osteoporoz ve diğer in vivo modeller, tamamlayıcıdır. Bu modeller cerrahi gerektiren ve önemli bir maliyetle 9 at, birkaç aya kadar sürebilir ancak kas-iskelet sistemi ile ilgili bozuklukların farklı yönlerini incelemek için çok yararlıdır. Ovariektomi uygulanmış olan (OVX) kemirgen modeli yumurtalıkların çıkarılması böylece insan menopoz sonrası osteoporoz 10 taklit eden estrojen eksikliğine yol açar deneysel bir hayvan modelidir. İnsan menopoz sonrası osteoporoz, östrojen yetersizliklerinin bir durumdurency kemik kırılmaları yönünden artan bir riske yol açar ve osteoporoz sadece Amerika Birleşik Devletleri'nde yaklaşık sekiz milyon kadınları etkiler. OVX modeli, menopoz sonrası osteoporoz için faydalı olmasına rağmen, genel olarak osteoporoz okuyan sınırlı avantajlar sunmaktadır. Östrojen yokluğunda bu nedenle de artmış osteoklast aktivitesi 10-12 görülmektedir, osteoklast uyarılması ve osteoblast apoptoz inhibe ederek, kemik kaybını önler. Kemik erimesini yana A RANKL'ın-OPG oranı dengesizlik ayrıca 13 görülmektedir. Büyüme faktörü β (TGF β), yüksek interlökin-7 (IL-7) ve TNF, IL-1 ve IL-6 14,15 dönüşüm seviyelerinin uzaması Bununla birlikte, in vivo koşullarında östrojen eksikliği de eşlik etmektedir. Bu sitokinler RANKL'ın yolunun kemik yeniden düzenleyici fonksiyonları bağımsız bilinen gibi, sadece RANKL-RANK eksenine herhangi bir osteoklast aktivasyonunu atfetmek mümkün değildir. Bu yazıda anlatılan modeli viv çalışma için araştırmacılar sağlaro pro-enflamatuar sitokinler olmaksızın osteoclastogenez ve kemik kaybına RANKL-RANK eksen OVX kemirgen modelleri ile karşılaştırıldığında.
Buna ek olarak, in vitro osteoklastojenezisi teknikleri kas-iskelet sistemi hastalıklarının tedavisi için potansiyel terapötik osteoklast aktivasyonunu çalışma için gerekli araçlardır. Daha önceki çalışmalar, aynı zamanda, fare makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ve fare sRANKL ile fare kemik iliğinden elde edilen makrofajların (BMMs) kültürlenmesi osteoclast farklılaşmasında 3,16,17 yol göstermiştir. Burada, fare kemik iliği hem de in vitro 18, insan periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) için çok çekirdekli osteoklast-benzeri hücreleri oluşturmak için protokolleri açıklanmıştır. Olgun terminal açıdan farklılaşmış ve tamamen işlevsel osteoklast tanımlamak için gerekli olan hücre bazlı deneyler, aynı zamanda kısaca açıklanmıştır. Bu in vitro teknikler vivo yaklaşım romanı tamamlamak ve p olarak hizmetowerful soruşturma araçlar osteoklast farklılaşmasını ve aktivasyonunu incelemek. Bu sistemleri kullanarak, bilim adamları, in vivo ve in vitro olarak osteoklastlar üretmek ve bunların proliferasyon ve aktivasyon için gerekli olan uyarıcılar ve sinyaller tespit hem de farmakolojik ve biyolojik inhibitörlerinin sonuç verirliğinin test edilmesi mümkün bulunmaktadır.
Kas-iskelet koşulları morbidite ve sakatlık nedenleri lider vardır ve 150'den fazla hastalık ve sendromların oluşmaktadır; Bugün yaklaşık 90 milyon Amerikalıyı etkileyen. Eklem enflamasyonu ve kemik yok artrit ve osteoporoz dahil olmak üzere kas-iskelet sistemi koşulları baskın özellikleri vardır. Osteoporoz genellikle kemik kırıkları yol açan kemik bütünlüğünü zayıflatan bir durumdur. Artrit şiş, hassas ve sert kısıtlayan normal hareket olmak ve sakatlığa yol açabilir eklem ilti…
The authors have nothing to disclose.
Research was partly supported by NIH research grants R01 AR062173 and SHC 250862 to IEA. ES is the recipient of NIH T32 CTSC predoctoral fellowship.
alpha-MEM | Life Technologies | 12561-056 | |
Human M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-096-492 | |
Mouse M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-094-643 | |
Human RANK-Ligand – soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-631 | |
Mouse RANK-Ligand – soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-076 | |
Tailveiner Restrainer for mice | Braintree | TV-150 STD | |
Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit | R&D systems | MTR00 | |
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma | 387A | |
MouseTRAP assay | immunodiagnostic systems | SB-TR103 |