소설<em> 생체</em> 유전자 전달 기술과<em> 시험관</em근골격계 질환의 뼈 손실의 연구를위한> 셀 기반 분석 실험
Summary
Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.
Abstract
Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.
Introduction
근골격계 질환은 국가 및 지역 보건 시스템 1에 대한 미국과 현재의 심각한 결과에있는 사람들의 수백만에 영향을 미칩니다. 이 질환은 뼈의 손실과 광범위한 치료 및 회복의 오랜 기간을 필요로 관절 기능을 특징으로한다. 일반적으로, 파골 세포의 수 및 / 또는 활성의 상대적 증가는 세포가 골다공증, 뼈 재 흡수하도록 특수화 및 관절염이 관찰된다. 생리적 조건에서 파골 세포의 수와 활성을 골아 세포에 의해 생산되는 핵 인자 κ B-리간드 (RANKL)의 수용체 활성에 의해 조절된다. 게린 (OPG), RANKL에 대한 미끼 수용체는 조골 세포 (3)에 의해 생성되는 조직 sRANKL의 과발현 또는 OPG의 삭제를 포함하는 생체 내 동물 모델 골다공증 연구에 매우 유용합니다.; 그러나,이 방법은 형질 전환 마우스 4,5의 생성을 필요로합니다. 여기서, 새로운 대안근골격계 관련 질환의 연구 sRANKL를 과발현하는 방법이 설명된다. 특히, minicircle (MC) DNA 기술 및 유체 전달 방법은 생체 내에서 sRANKL의 유전자 전달을 달성하고 체계적으로 6 마우스 sRANKL를 과발현하는 데 사용되었습니다.
이 방법은 또한 낮은 칼슘 다이어트 (8)에 의해 난소 7식이 개입을 다음 파골 세포의 호르몬 변조 골다공증의 다른 생체 모델을 보완. 이 모델들은 수술 절차가 필요하고 상당한 비용 9에서 몇 달까지 걸릴 수 있습니다 그러나 근골격계 관련 질환의 다양한 측면을 연구하는 것은 매우 유용하다. 난소 절제 (OVX) 설치류 모델은 난소를 제거함으로써 인간의 폐경 후 골다공증 (10)을 흉내 낸 에스트로겐 결핍에 이르게 실험 동물 모델입니다. 인간의 폐경 후 골다공증, 에스트로겐 defici 조건ency은 골절의 위험이 증가로 연결 골다공증은 미국에서만 약 8 백만명의 여자에 영향을 미칩니다. OVX 모델은 폐경 후 골다공증에 유용하지만 그것은 일반적으로 골다공증을 연구하는 제한된 이점을 제공합니다. 에스트로겐 따라서 그것의 부재에서 증가 된 파골 세포 활성은 10-12을 관찰하고, 파골 세포 및 조골 세포 유도 세포 사멸을 억제함으로써, 골 손실을 억제한다. 골 흡수 호의 RANKL-OPG 비율 불균형도 13를 관찰된다. 성장 인자 β (TGF β의), 증가 된 인터루킨 12 (IL-12) 및 TNF, IL-1 및 IL-6 (14, 15)를 변형의 수준을 감소함으로써 그러나, 생체 내에서 에스트로겐 결핍도 수반한다. 이러한 사이토 카인은 RANKL 경로의 뼈 리모델링 조절 성 기능을 독립적 알고있다, 그것은 전적으로 RANKL-RANK 축에있는 파골 세포의 활성화를 속성 수 없다. 이 문서에 설명 된 모델은 비브에서 공부하는 연구자 수오 전 염증성 사이토 카인없이 파골 세포와 뼈 손실에 RANKL-RANK 축이 OVX 쥐 모델에 비해.
또한, 체외 파골 세포 기술은 근골격계 질환의 잠재적 인 치료 트리트먼트의 파골 세포의 활성을 연구하는 중요한 도구입니다. 이전 연구는 또한 마우스 대 식세포 집락 자극 인자 (M-CSF)와 마우스 sRANKL와 마우스 골수 유래 대 식세포 (BMMs)를 배양하는 파골 세포의 분화 3,16,17로 이어질 수있는 것으로 나타났습니다. 여기서, 마우스 골수로부터뿐만 아니라 체외 (18)에서 인간의 말초 혈 단핵 세포 (PBMC를)까지 다핵 파골 세포 – 유사 세포를 생성하는 프로토콜이 설명된다. 성숙한 말기 차별화 된 완벽한 기능 파골 세포를 정의하는 데 필요한 세포 기반 분석도 간략하게 설명되어 있습니다. 체외 기술은 생체 방식의 소설을 보완하고 함께 P 역할owerful 조사 도구는 파골 세포의 분화 및 활성화를 공부한다. 이러한 시스템을 사용하여, 과학자들은 생체 내 및 시험관 내에서 파골 세포 생성 및 증식 및 활성화에 필요한 자극 및 신호를 정의 할뿐만 아니라 약리학 적 및 생물학적 억제제의 효능을 시험 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
근골격계 조건은 병적 상태와 장애의 원인을 선도하고 150 개 이상의 질병 및 증후군 구성되어 있습니다; 현재 약 90 만 명의 미국인에 영향을 미치는. 관절 염증 및 골 파괴는 관절염과 골다공증 등의 근골격 조건의 주된 기능이다. 골다공증은 주로 뼈의 골절로 이어지는 뼈의 무결성을 약화 조건이다. 관절염은 부어, 부드럽고 뻣뻣한 제한 정상적인 운동이되어 장애로 이어질 수있는 관절의 염증?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research was partly supported by NIH research grants R01 AR062173 and SHC 250862 to IEA. ES is the recipient of NIH T32 CTSC predoctoral fellowship.
Materials
| alpha-MEM | Life Technologies | 12561-056 | |
| Human M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-096-492 | |
| Mouse M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-094-643 | |
| Human RANK-Ligand – soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-631 | |
| Mouse RANK-Ligand – soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-076 | |
| Tailveiner Restrainer for mice | Braintree | TV-150 STD | |
| Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit | R&D systems | MTR00 | |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma | 387A | |
| MouseTRAP assay | immunodiagnostic systems | SB-TR103 |
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