A Novel<em> In vivo</em> Gene Transfer Teknik och<em> In vitro</em> cellbaserade analyser för studier av benförlust i belastningsskador

Summary

Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.

Abstract

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.

Introduction

Muskuloskeletala sjukdomar drabbar miljontals människor i USA och nuvarande allvarliga konsekvenser för nationella och lokala hälso-och sjukvårdssystemen ^1. Dessa sjukdomar kännetecknas av förlust av ben och gemensamma funktion som kräver omfattande behandling och långa perioder av återhämtning. Vanligen en relativ ökning av antalet och / eller aktiviteten av osteoklaster, celler specialiserade för att resorberas ben, vid osteoporos och artrit observeras ^2. Under fysiologiska betingelser av antalet och aktiviteten av osteoklaster regleras av receptor aktivator av nukleär faktor κ-B-ligand (RANKL), som produceras av osteoblaster. Osteoprotegerin (OPG), är ett lockbete receptor för RANKL också produceras av osteoblaster ³ In vivo djurmodeller som innebär systemuttryck av sRANKL, eller radering av OPG är mycket värdefulla i osteoporosforskning.; Men dessa metoder kräver generering av transgena möss ^4,5. Här har ett nytt alternativmetod för att överuttrycka sRANKL för studier av muskuloskeletala relaterade störningar beskrivs. Specifikt var minicircle (MC) DNA-teknik och hydrodynamiska leveransmetoder som används för att uppnå genöverföring av sRANKL in vivo och överuttrycker mus sRANKL system ^6.

Denna metod är också ett komplement till andra in vivo-modeller av benskörhet, till exempel hormonella modulering av osteoklaster efter ovariektomi ⁷ och dietary intervention av låg-kalcium diet ^8. Dessa modeller är mycket användbara för att studera olika aspekter av belastningsrelaterade besvär men de kräver kirurgiska ingrepp och kan ta upp till flera månader, till stora kostnader ^9. Äggstockar (OVX) gnagarmodell är en experimentell djurmodell där avlägsnande av äggstockarna leder till östrogenbrist och därmed härma mänskligt postmenopausal osteoporos ^10. Human post-menopausal osteoporos, ett tillstånd där östrogen Deficitransparensen leder till ökad risk för benfrakturer och benskörhet drabbar cirka åtta miljoner kvinnor i USA ensam. Fastän OVX modell är användbar för post-menopausal osteoporos är det inte ger några större fördelar i att studera osteoporos i allmänhet. Östrogen hämmar benförlust, genom att inducera osteoklaster och hämma osteoblast apoptos, alltså i sin frånvaro en ökad osteoklastaktivitet observeras ^10-12. En RANKL-OPG förhållande obalans som gynnar benresorption observeras också ^13. Emellertid är östrogenbrist in vivo också åtföljas av minskade nivåer av transformerande tillväxtfaktor β (TGF β), ökad interleukin-7 (IL-7) och TNF, IL-1 och IL-6 ^14,15. Eftersom dessa cytokiner har känt benremodellering modulatoriska funktioner oberoende av RANKL reaktionsvägen, är det omöjligt att tillskriva någon osteoklast-aktivering enbart till den RANKL-RANK axel. Modellen som beskrivs i detta dokument ger forskarna möjlighet att studera i vivo RANKL-rank-axeln i osteoclastogenesis och benförlust utan proinflammatoriska cytokiner jämfört med OVX gnagarmodeller.

Dessutom, in vitro osteoclastogenesis tekniker är viktiga verktyg för att studera osteoclast aktivering för potentiella terapeutiska behandlingar av sjukdomar i rörelseorganen. Tidigare studier har också visat att odling av mus-benmärg härledda makrofager (BMMs) med mus-makrofag kolonistimulerande faktor (M-CSF) och mus sRANKL kan leda till osteoklastdifferentiering ^3,16,17. Här är de protokoll för att generera flerkärniga osteoklaster-liknande celler från benmärg från mus samt från humana perifera mononukleära blodceller (PBMC) in vitro ¹⁸ beskrivs. De cell-baserade analyser som krävs för att definiera en mogen terminalt differentierade och fullt funktionell osteoklast är också kortfattat beskrivas. Dessa in vitro-tekniker kompletterar romanen in vivo strategi och tillsammans fungera som powerful undersökande verktyg för att studera osteoklastdifferentiering och-aktivering. Med hjälp av dessa system, forskare kan generera osteoklaster in vivo och in vitro och definierar stimuli och signaler som krävs för deras spridning och aktivering samt testa effekten av farmakologiska och biologiska hämmare.

Protocol

1. Hydrodynamisk Leverans av sRANKL MC DNA Hydrodynamisk Leverans via Mouse Tail Vein Väg musen innan injektion i svansvenen. Späd sRANKL eller grönt fluorescerande protein (GFP) MC i Ringers lösning (pre-varm vid 37 ° C) i en total volym av ~ 10% av musens kroppsvikt. Värm upp musen i en bur i 10 min före injektion för att vidga blodkärlen och göra laterala vener (LVs) synliga. Övervaka musen försiktigt för att undvika uttorkning och hypertermi. Så snart LVs är dil…

Representative Results

Här är en ny gen överföringsteknik för differentiering av osteoklaster in vivo-och cellodlings protokoll för differentiering av prekursorceller i osteoklaster in vitro som en metod för att studera effekterna av cytokiner på osteoclastogenesis beskrivs. I fig. 1 är de representativa resultat av framgångsrik genöverföring av GFP och mus sRANKL MC i möss visas. I figur 2, är representativa bilder av benmärg från mus eller humana PBMC-celldifferentiering ti…

Discussion

Muskuloskeletala förhållanden är ledande orsakerna till sjuklighet och funktionshinder och består av över 150 sjukdomar och syndrom; drabbar cirka 90 miljoner amerikaner idag. Ledinflammation och benförstöring är dominerande inslag i muskuloskeletala förhållanden, bland annat artrit och benskörhet. Benskörhet är ett tillstånd som försvagar ben integritet, vilket ofta leder till frakturer i benet. Artrit är en kronisk, invalidiserande sjukdom som kännetecknas av inflammation i lederna som blir svullna, ?…

Materials

alpha-MEM	Life Technologies	12561-056
Human M-CSF	Miltenyi Biotec	130-096-492
Mouse M-CSF	Miltenyi Biotec	130-094-643
Human RANK-Ligand – soluble	Miltenyi Biotec	130-094-631
Mouse RANK-Ligand – soluble	Miltenyi Biotec	130-094-076
Tailveiner Restrainer for mice	Braintree	TV-150 STD
Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit	R&D systems	MTR00
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit	Sigma	387A
MouseTRAP assay	immunodiagnostic systems	SB-TR103