Abstract
포유류 및 노랑 초파리의 정자 중에 수컷 생식 세포가 필수적 발생 과정의 일련의 개발. 이 줄기 세포 인구, 유사 분열 증폭 및 감수 분열에서 차별화가 포함되어 있습니다. 또한, 포스트 - 감수 세균 세포 형태학 극적인 재 형성 공정뿐만 아니라 생식 라인 염색질 히스톤 투 프로타민 스위치 글로벌 후생 유전 학적 재구성을 겪는다.
돌연변이 또는 기타 유전 적 도구를 사용하여 포스트 감수 정자에서 단백질의 역할을 연구하는 것이 종종 필수적 배아 사전 감수, 또는 조사 하에서 감수 단백질의 기능에 의해 방해된다. 이러한 단백질의 돌연변이 체의 사후 감수 표현형의 발달 이전 블록을 통해 가려 질 수있는, 또는 표현형의 해석은 복잡 할 수있다. 모델 생물 초파리 melanogaster가이 문제에 대한 바이 패스 제공 : 그대로 고환 및초기 번데기 해부 생식 세포의 경우에도 낭종 배지에서 체외 개발할 수있다. 이러한 문화를 만들기 사용은 고환과 배아 줄 낭종의 생식 세포 생활의 미세한 영상을 수 있습니다. 중요한 것은, 재배 및 고환 생식 세포는 감수함으로써 사후 단계를 포함하여, 정자 중에 효소 기능의 조작을 허용하는, 약리학 적 억제제가 액세스된다.
제시된 프로토콜은 해부 번데기 고환 생식 세포 낭종을 배양하는 방법에 대해 설명합니다. 번데기 고환 및 배양 조건의 개발에 대한 정보는 문화에 살고 고환 생식 세포 낭종의 현미경 영상 데이터와 함께 제공됩니다. 또한 히스톤 아세틸 트랜스퍼 라제 억제제 anacardic 산을 사용하여 히스톤 투 프로타민 스위치를 표적 분석을들 포스트 감수 정자 형성을 연구하는 약리학 적 분석을 설명한다. 원칙적으로,이 배양 방법은 많은 O를 해결하도록 구성 될 수있다사전 및 사후 감수 정자에서 거기 연구 질문.
Introduction
많은 종의 수컷 생식 세포의 발달 과정은 순차적이다. 형태 학적 및 성적으로 고도의 전문 정자의 형성에 절정에 중요한 일련의 사건이 특징입니다. 초파리에서, 고환 분할의 끝에서 세균 라인 줄기 세포는 비대칭 1,2 (개요를 그림 1 참조) 새로운 줄기 세포와 spermatogonium, 즉 차별화하기 위해 최선을 다하고 딸 셀을 야기합니다 . spermatogonium는 감수 분열의 시작과 함께 인상적인 성장과 전사 활동의 단계가 spermatocyte 단계라고, 유사 분열 분열의 네 라운드를 거쳐합니다. 하나 spermatogonium 유래 세포는 서로 접속하고이 체세포-구조 낭종이라고도 래핑 동기화 번들로 발전 유지. 감수 분열이 완료되면, 수컷 생식 세포의 형태가 완전히재구성 (개략적으로도 1에 도시). 처음 라운드 정자는 유체 역학적 헤드 구조를 형성하는 신장 및 편모가 개발한다. 5 - 결국, 정자 세포는 개별화 3이라는 복잡한 세포 자멸 - 관련 메카니즘에 의해 서로 분리된다.
9 - 노랑 초파리와 포유 동물 종을 포함하여 많은 종에서는 반수체 남성 생식 세포의 크로 마틴의 놀라운 후생 유전 학적 재 배열을 동반 생식 세포의 형태 학적 변화는 (HP 스위치) 6 히스톤 - 투 - 프로타민 스위치를했다. 아마도 거의 모든 표준 히스톤 많은 히스톤 변종 분자는 DNA에서 제거하고 성숙 정자의 크로 마틴에 특정 매우 컴팩트 한 nucleoprotamine 구조의 결과로 작은 기본적인 단백질 프로타민에 의해 대체된다. HP 스위치의 일반적인 특성은 t이다먼저 전이 단백질에 의해, 그리고 마지막으로 프로타민에 의한 히스톤 변형에 의해 정식 히스톤의 그는 교체. 12 -이 모든 히스톤 제거 7,10 직전에 같은 히스톤 H4의 아세틸 화 수준의 급등 등의 후생 유전 학적 마크가 일부 변경, 동반한다.
전부는 아니지만 대부분은, 상술 된 공정의 성숙, 완전히 가임 정자의 개발에 필수적이다. 이것은 포유류의 정자의 공유로, 무척추 시스템 1,8,9와 유사성 상당한 양의 초파리뿐만 아니라 인간뿐만 아니라 사실이다. 남성 생식 세포 발달을 공부하는 것은 크게 초파리 모델 시스템에서 촉진된다. 파리는 유 전적으로 매우 액세스 할 수 있습니다. 돌연변이의 발생뿐만 아니라 융합 유전자 또는 RNA 간섭 플라이 구조 발현 균주의 설립은 적은 노력한다. 그러나, 포스트 - 감수 정자, 돌연변이 체의 사용 연구D 유전자 간단한 도구 한계에 도달 할 수 있었다. 초파리의 정자에서 전사는 감수 분열에 항목으로 거의 완전히 중단. 16 - 따라서, 포스트 감수 정자는 주로 확장 감수 의향 (13)에서 합성 병진 억압 저장 mRNA를 기반으로합니다. 따라서, RNA 간섭 또는 비 조건부 변이체의 사용과 같은 도구는 또한 특별히 미리 감수 또는 감수 생식 세포 발달에 필수적인 기능을 수행 유전자 산물의 사후 감수 역할을 연구하는데 적합하지 않다.
20 - 이러한 경우에 이용 될 수있다 초파리의 장점 중 하나는 문화 매체 4,12,17에 생체 개발을 해부 그대로 고환 생식 세포의 경우에도 낭종의 능력이다. 고환이나 세균 줄 낭종의 해부 및 재배는 살아있는 세포에서 배아 세포 개발뿐만 아니라 현미경 관찰을 할 수 있지만LSO와 약리학 적 분석의 사용 등, 이러한 히스톤 acetyltransferases (HAT들), 히스톤 디 아세틸 라제 (HDACs), 토포 이소 머라 제 또는 테아 같은 효소 복합체의 억제제. 따라서, 포스트 - 감수 정자 중에 효소 기능을 조작과 관계없이, 전 배아 감수 또는 감수 4,12 기능의 발달 결과를 모니터링하는 것이 가능하다.
약리학 적 분석에서, 우리는 이전 감수 의향 동안 bromodomain 단백질의 아세틸 화에 의존하는 지역화뿐만 아니라 모자 HDACs 12,21 타겟팅 특정 억제제를 사용하여 포스트 감수 정자의 후생 유전 학적 HP 스위치 히스톤 아세틸 화 수준의 관련성을 분석 하였다. 이러한 분석에서 HP 스위치를 표적으로하는 융합 유전자 histone2AvD-RFP 및 내인성 패턴 protamineB-eGFP는 12, 22를 표현하는 비행의 피로를 사용하여 가능하게하고, 관찰 한 것번데기 고환에서 정자 제 24 및 48 시간 (12) 사이 APF HP 스위치를 통과한다.
제시된 프로토콜은 초파리의 번데기, 배양 조건, 그대로 번데기 고환과 약물 분석에서 고환 및 낭종의 절개를 설명합니다. 이를 위해, 번데기 형성 (APF) 후 약 24 시간에서 번데기 고환 해부 (도 1 및 2 참조). 이때, 정소는 다른 조직에 대한 연결을하지 않은과 억제제 화합물 23,24으로 더 침투를 허용 만 얇은 외피에 의해 둘러싸여있다. 고환은 쉽게 문화에 취할 수 bean- 또는 서양 배 모양의 기관입니다. 이 고환 배양, 해부, 특정 억제제로 처리됩니다. 이어서, 억제제의 효과는 면역 형광 분석하고 융합 단백질 발현을 형광 현미경을 사용하여 관찰하고, 핵 morphol 비교함으로써미처리 된 생식 세포의 치료에 생식 세포의이 ogy. 이 프로토콜에서 제시하는 조건은 문화 고환 생식 세포 낭종을 개발의 라이브 영상을 수 있습니다.
Protocol
윤리 문 :
이 프로토콜에 기술 된 실험 절차는 독점적 초파리 작업 및 독일의 동물 복지 관련 법률의 적용을받을 수 없습니다 포함한다.
미디어, 도구, 그리고 파리의 1 준비
- 탄산 수소 칼륨 17없이 변경 시판 가루 M3 성장 매체를 준비합니다. 주의 : 눈과 피부를 자극 함. 10 % 소 태아 혈청으로 보충 배지, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg은 / ㎖ 스트렙토 마이신. 최상의 결과를 위해 열 불 활성화 및 곤충 배양 테스트 태아 혈청을 사용합니다. -20 ° C에서 분취에서 0.2 μm의 병 상단 필터 장치 및 저장을 통해 (중간이라고 함) 완전 배지를 필터링합니다. 사용 전에 필터 (0.2 μm의 주사기 필터 팁) 매체는 다시 침전물을 제거합니다.
- 약리학 적 분석에 대한 억제제 원액을 준비합니다. Dissol분량 씩 적당한 용매 및 저장소의 화학 물질을했습니다. (: 눈과 피부를 자극주의)을 디메틸 설폭 시드 예를 들어, 28.69 mM의 anacardic 산의 재고 솔루션을 준비합니다.
- 해부 번데기 고환 및 단일 낭종 절제술의 중단을위한 도구를 준비합니다. 이 샤프하고 딱딱한 바늘보다는 포셉 쌍을 사용한다. 집게의 쌍의 2 개의 아암 사이에 개발 모세관 력은 매우 어려운 매체 소량 단일 낭종 절개한다. 예를 들어, 접종 루프 홀더에 삽입 스테인리스 곤충 핀의 끝을 사용한다.
- 성인 초파리 충분한 수 (약 40-60 파리)와 적절 세 번데기, 씨앗을 약 10 대형 배양 병 (4cm 직경 튜브)를 얻기 위해. HP 스위치를 분석하기 위해, 자신의 내생 패턴 12,16,22에 H2AvD-RFP 및 ProtamineB-eGFP는 표현 파리를 사용합니다. 25 ℃ 표준 조건 하에서 배양 바이알; 최대 4-5일 셋째-령 유충 크롤링까지 약에 대한 C ° 및 튜브 (25)의 벽에 번데기를 시작합니다.
해부를위한 24 시간짜리 번데기를 구하는 2 마킹 또는 화이트 수집 예비 - 번데기
- , HP 스위치에 특정 화학 물질의 영향을 테스트 약 24 시간 APF 12에서 번데기 고환을 해부합니다. 무대 번데기를 구하려면 유충을 pupating로 준비된 플라이 문화 유리 병을 (섹션 1.4 참조) 가능한 많은 흰색 사전 번데기를 식별합니다. 번데기에서 첫 번째 단계에서 사전 번데기는 움직이지 않은 먹이, everted spiracles과 흰색 색상의 번데기와 오히려 단축 애벌레로 나타납니다. 번데기는 번데기 개발 (26)의 다음 단계를 나타냅니다 30-60 분, 내 황갈색 갈색이된다.
- 튜브의 외측에 영구 마커 사전 번데기의 위치를 표시한다. 약 24 시간 동안 25 ° C에서 튜브를 품어.
- 또한,PBS 버퍼에 적신 작은 붓으로 유리 병의 측면에서 사전 번데기을 선택합니다. 그런 다음 새로운 50 ㎖의 반응 관의 측면에 사전 번데기를 전송하고 약 24 시간 동안 25 ° C에서 배양.
번데기 형성 후 약 24 시간에서 번데기 고환의 3 해부
- 10cm 플라스틱 세포 배양 또는 배양 접시에 매체의 몇 방울 (약 80 ㎕의 각)를 배포합니다. 집게의 폭 넓은 쌍 또는 중간에 적신 브러쉬를 사용하여, (섹션 2 참조) 배양 병에서 24 시간 APF 단계에서 번데기을 선택합니다. 접시에 매체의 각 드롭 한 번데기를 전송합니다.
- 절개를 들어, 광섬유 일루미네이터 구비 입체 현미경을 사용한다. 이 문화에 적절한 개발을 방지 할 수로 해부하는 동안 RT 위 고환에 열을 가하지 마십시오.
- 제 5 집게 이쌍와 번데기를 해부하다. 한 쌍으로, 가장 후방에서 번데기를 잡아일부 (후부 spiracles) 및 위치에 고정.
- 포셉의 다른 쌍의 앞쪽에 spiracles을 잡고 그 앞쪽 끝에서 번데기 아가미를 엽니 다. 흉부의 적어도 일부가 노출 될 때까지 번데기 케이스를 벗겨.
- 가장 후단에 의해 위치에 번데기를 계속 누르고 있습니다. 번데기의 내부 압력을 해제하려면, 번데기의 머리 영역으로 집게의 쌍의 두 팔을 삽입합니다.
- 집게를 열고 앞쪽 방향으로 집게를 이동하여 열려있는 번데기를 추출. 이 운동으로 생성 된 개방의 첫 번째 시도에서 가능한 한 커야합니다. 압력이 고환이 작은 구멍을 통해 직접 추진되고 가장 자주 중단되고이 있으므로 출시되기 전에 그 후방 끝에서 번데기의 손상을 방지.
- 번데기가 개방되면, 번데기의 방출 내압 라 통해 신체 지방 세포 및 조직의 응집체를 누르는 것을 관찰헤드 영역 RGE 개구. 번데기 고환이 이미이 물질 번데기 밀려되었는지 여부를 확인합니다; 이는 어떤 경우에 일어난다. 고환은 24 시간 APF에서 다른 조직에 연결되어 있지 않은, 따라서 번데기 23에서 쉽게 배출 될 수 있습니다.
- 그들은 번데기에 남아있는 경우이 고환 손상을 줄 수 있으므로 집게와 번데기를 압박하지 마십시오. 한 쌍의 핀셋을 사용하여 개구의 크기를 증가시킨다.
- 그런 다음 가장 후단에 번데기를 개최합니다. 번데기에서 고환을 해제 전방에 후방에서 번데기의 내용을 밖으로 다른 집게 쌍 부드럽게 행진을 닫습니다.
- 미리 잘라 200 μL 피펫 팁으로 그들을 잡아 당겨 고환을 수집합니다. 고환과 전송 체 지방 세포의 수를 줄이기 위해 매체의 단지 매우 소량의 전송을 시도. 새로운 배양 접시에서 매체로 고환을 놓습니다. 단 몇 지방 바디 셀 때까지 고환에게 매체와 여러 번 세척의는 남아있다.
- 라이브 영상의 경우, 매체와 유리 바닥 배양 접시에 고환을 전송하고 반전 영상 현미경을 사용합니다. 약물 분석의 경우, 5 단계를 계속합니다.
남성 생식 줄 낭종 및 라이브 영상의 4 해부
- 유리 바닥 배양 접시에 하나 이상의 번데기 고환을 전송합니다.
- 광섬유 조명과 두 개의 스테인레스 스틸 바늘 스테레오 현미경을 사용하여 남성 생식 세포 낭종의 해부 (1.3 절 참조).
- 한 바늘,주의 깊게 전방 또는 후방 끝에 하나의 고환을 고정하려고합니다. 위치를 잡습니다. 고환에 다른 바늘을 삽입하고 옆으로 바늘을 이동하여 고환 칼집을 방해. 낭종의 대부분은이 운동에 의해 고환에서 발표 될 예정이다.
- 한 바늘 위치에있는 고환을 계속 누르고 있습니다. 다른 바늘 고환에서 남아있는 낭종 밖으로 조심스럽게 행진.
- 신사로 구분 집계 낭종 중LY는 낭종의 클러스터를 통해 또는 200 μL 피펫 팁을 사용하여 매체와 새로운 배양 접시에 낭종을 전송하여 옆으로 바늘을 이동.
- 단일 낭종의 라이브 이미징을위한 반전 영상 현미경으로 배양 접시를 이동합니다. 바늘 필요하다면 다시 낭종을 분산.
- 위상 콘트라스트와 형광 현미경을 사용하여 낭종의 무대를 확인합니다.
- 원하는 단계의 낭종에 초점을 맞 춥니 다. 낭종이 배양 접시의 바닥에 부착하기 때문에 초점이 떠있는 경향이하지 않는, 자주 이상 이미징 실험을하는 동안 초점과 낭종의 위치를 확인합니다.
참고 : 고정화 폴리-L-라이신과 함께 요리를 코팅하는 초기 배아 줄 낭종의 발전에 해 롭습니다. 대신, 개별 낭종이 분리 될 수있다. 약간의 연습으로, 아주 조심스럽게 바늘로 눌러 특정 낭종을 지목 할 수있다. 이것은 별도의 숭배 단일 낭종의 전송을 허용합니다현미경의 시야에 맞는 그려진 아웃 팁 유리 파스퇴르 피펫 우레 요리. 격리 된 낭종은 다음도 쉽게 장기 배양 한 후 배양 접시에 재배치 할 수 있습니다.
본래 번데기 고환과 5 약리 분석
- 12 회 반복 한 실험의 배지 500 ㎕를 함께 24 - 웰 세포 배양 플레이트의 각 웰을 채운다. 미리 잘라 200 μL 피펫 팁을 사용하여 각 웰에 전송 한 번데기의 고환.
- 거꾸로 형광 현미경을 사용하여 격리 된 고환에서 프로타민의 존재를 확인합니다. 고환은 HP 스위치가 낭종의 하나에 자리를 차지하게되지 않았 음을 나타냅니다 ProtamineB-eGFP는 신호 없어야합니다. 이미 ProtamineB-eGFP는 양성 낭종을 보여 고환을 교체합니다.
- 제 12 웰에 원하는 최종 농도에 도달하기 위해 희석 된 저해제 화합물 (anacardic 산)을 함유하는 배지 500 μl를 추가웰당 배지 1 ㎖ 중의 (150 μM). 처리되지 않은 컨트롤과 같은 나머지 우물을 사용; 억제제 화합물과 함께 사용되는 용매로 동일한 양으로 배지 500 μl를 추가한다. 주 : 많은 다른 화합물 및 용매를 사용하는 경우, 대조군으로 단독 배지를 사용하는 것이 더 효율적일 수 있으며 별도의 실험에서, 용매의 농도를 증가의 영향을 테스트하기 위해.
- 어둠 속에서 24 시간 동안 25 ° C에서 접시를 품어.
- 전술 한 바와 같이 배양 고환에 프로타민의 존재를 다시 확인합니다. 제어 고환 이제 HP 스위치를 통해 전환을 나타내는 하나 이상의 ProtamineB-eGFP는 양성 낭종을 표시해야합니다.
- 200 ㎕의 팁과 피펫을 사용하여, 폴리-L-라이신 코팅 된 슬라이드에 고환을 전송 다른 12,27,28 설명 된대로 적절한 형광 항체 스쿼시 준비 및 얼룩을합니다.
Representative Results
초파리 수컷 정소 이미 배아 형성 및 애벌레 단계 동안 체강에서 계속된다. 공급 령 유충 쇼 작고 둥근 고환 미래 색소 세포의 층으로 둘러싸인 지방 신체 조직 (도 2a)에 매립. 성인 남성에서 파리 정소 생식기 디스크 및 안료 층 (24)에서 발생하는 근육 세포의 층에 의해 덮여있다 긴 코일 튜브이다. 흥미롭게도, 애벌레 고환이 감수 의향에 해당하는 기본 spermatocyte 단계까지 사전 감수 및 감수 단계 만 배아 줄 세포를 포함 23 (또한 그림 1 참조). 남성 생식 세포의 제 코호트 번데기 형성 감수 분열 동안 통과. 약 24 시간 APF에서 긴 편모를 가진 후 감수 단계는 이미 개발 한 모든 핵 히스톤 H2AvD-RFP 포함 (그림 1 및 2B). 정자 중에 t 시행하지 않았그 아니 ProtamineB-eGFP는 신호로서 HP 스위치 형광 현미경 (도 2c)에 의해 검출 될 수있다. 자주,이 단계에서 해부 고환 오일 몇 방울 (그림 2C, 화살촉)에 지방이 신체 세포의 덩어리 또는 하나의 연상 가변 크기의 자동 형광 구조를 포함하고있다. 고환 내에서이 구조는 위상차 현미경으로 볼 수 있습니다. 지금까지, 우리는 문학의 성격의 설명을 발견하지 않았습니다. 36 시간 APF에서 해부 고환은 신장 어떤 경우에는 이미 (그림 2D)를 곱슬 곱슬하기 시작 나타납니다. 그들은 이미 생식기, 상상 디스크 (23, 24)로부터 성장하는 생식기의 조직에 부착했다. 또한, 그들은 자주 ProtamineB-eGFP는 신호 (그림 1 및 2 차원, 화살표)로 나타낸 바와 같이, HP 스위치 이상으로 첫번째 정자가 포함되어 있습니다. 48 시간의 APF에서 고환이 더 연장이 명확하게 컬링을 시작기단. 프로타민 양성 핵을 가진 여러 세균 줄 낭종 (화살표, 그림 2E) 볼을된다.
24 시간 APF에서 해부 고환이 24 시간 동안 문화에 보관하는 경우, 그들은 그대로 파리에서와 같이 길게하지 않는다 ( '그림 2D를 비교하고도 6A와 2E). 이는 일반적으로 그 후방 팁 23,29에서 정소 접촉 현상 생식기 위치로부터 송신 된 신호 및 성장의 부족 가능성이다. 초기 myotubes는 고환 24 생식기 디스크에서 마이그레이션 할 수 있기 때문에 또한, 고환 시스의 근육 층은 발생하지 않습니다. 고환 시스 -이 상황은 전적으로 얇은 안료 층 않습니다 내 생식 세포 개발의 증가를 싸고있는 문화를 충분히 성장없는 것. 그러나, 생식 세포는 분열을 성장하고, 독립적으로 고환 시스의 차별화. 따라서, 36 시간 이상 후에문화 r은 초기 고환이 자주 터져하고, 추가 개발이 관찰되지 않습니다. 그러나, 더 짧은 시간 내에, 그것이도 3a -3 C에 의해 알 수 있듯이, 문화 현상 전체 정소의 경과 생체 라이브 화상을 기록 할 수있다 (도 1 보조 비디오 참조). 약 45 시간의 APF에서 해부 번데기 고환은 6 시간 동안 배지에서 배양하고 5 분마다 몇 군데 있었다. 이 시간 프레임 내에서 정자의 여러 낭종은 HP 스위치 단계에서 등장하고 ( '-3 C를 열고 화살표를도 3a) 밝은 ProtamineB-eGFP는 신호를 보여줍니다.
위에서 언급 한 바와 같이, 초파리 고환에서 남성의 생식 세포가 상호 연결된 세포의 동기화 번들로 발전이라는 낭종 1. 그림 4a는 약 24 시간 APF에서 번데기 고환 해부 낭종의 개요를 보여줍니다. 사전 감수 단계, 감수 단계, 후 초기 감수 단계, 또한 (그림 1 (b) -4 E)를 찾을 수있는 HP 스위치 이전에 연장 된 핵을 가진 초기 카누 단계에서 낭종. 격리 된 낭종은 매우 약하기 때문에 신중하게 처리해야한다. 낭종의 봉투를 형성하고이 체세포 쉽게 기계적으로 중단 될 수 있습니다. 생식 - 라인 줄기 세포는 생체 내 생존하고 30 체세포 낭종 세포의 유전자 절제 후에 분할 계속하는 능력을 가지고있다. 이는 시험관 내에서, 16 세포 단계의 배아 세포가 더욱 발전하고 19 차별화 그들의 봉투 체세포로부터 분리하는 것이보고되어있다. 사실, 우리는 아마 늦은 정모 세포는 매우 드물게 나마 중단 낭종 세포 감수 분열을 완료 우리의 문화 시스템에서 나타났습니다. 대부분의 자주,이 중단 낭종 개발을 중단. 제시된 프로토콜에 따라, 어떤 경우에는 그대로 낭종 수도는 dev에72 시간의 최대 엘롭 체외 문화 매체. 그러나, 우리는 낭종의 적절한 수는 배양 48 시간까지 살아남을 것을 관찰했다. 이 기간 내에, 배양 낭종 HP 이후 늦은 카누 스테이지 (12)를 전환 할 때까지 감수 분열 후까지뿐만 아니라 히스톤 기반 염색질 가진 둥근 핵 단계에서 기본 spermatocyte 단계에서 개발할 수있다. 이 정모 세포는 감수 분열 (그림 5와 2 보충 비디오)를 입력, 예를 들어 같은 정자에서 중요한 프로세스의 라이브 영상을 수 있습니다. 이 실험을 위해, RFP-태그 된 히스톤 변형 H2AvD은 염색체 마커로 사용 하였다. 기본 spermatocyte 스테이지 (31)에 생체을 약 3 일간 연장된다. 따라서, 감수 분열을 기록하기 위해, 우리는 눈에 띄게 크로 마틴 응축 (그림 5A, 영역 2)을 시작했다 정모 세포로 낭종을 선택했다. 감수 분열은 정모 세포에서 시작나머지 정모 세포에서 웨이브 다음 다음 낭종 한쪽과 (영역 1 내지 영역 (2)에서도 5a에서,도 2 보조 비디오 참조). 염색질의 응축 곧 밝은 반점 (그림 5A, 영역 2)로 볼 수 있습니다 빠르게 움직이는 염색체에 연결됩니다. 30 분 후,이 지역의 첫 번째 정모 세포 (그림 5B, 화살촉) telophase 이미. 젊은 지역 하나의 염색체는 중기 판 20 분 이상 (그림 5C)에 정렬합니다. 그들은 완전한 telophase과는 약 15 분 이상 (그림 5D) 세포질 분열을받을 준비가되어 있습니다. anaphase (핵분열 말기)는 telophase 및 세포질 분열이 기록 (보충 비디오 2)에서 약 10 분 지속되었다.
포유 동물에서,뿐만 아니라 초파리, 히스톤 H4 아세틸에서 현저한 증가는 사후 감수 동안 히스톤 제거 및 HP 스위치의 발병을 표시정자 6,11. 그것은이 후성 유전 적 변형은 필수 구성 요소 또는 HP의 발달 프로그램의 경우에도 트리거 10,32을 전환 할 것을 제안되었다. 이전에, 우리는 억제제 포스트 감수 단계 12시 히스톤 H4의 아세틸 화 수준에 영향을 모자와 HDACs을 대상으로 문화 초파리의 번데기의 고환을 처리 하였다. 이러한 약물 학적 분석에서, 우리는 히스톤 아세틸 화는 프로타민 기반의 크로 마틴과 단계에 히스톤 기반의 크로 마틴과 단계에서 정자의 진행에 필수적인 것으로 나타났습니다.
그림 6과 7은 번데기 고환의 모자를 대상으로 anacardic 산을 사용하여 약물 분석의 대표적인 결과를 보여줍니다. 24 시간 APF에서 고환 H2AvD-RFP 및 ProtamineB-eGFP는 표현 플라이 변형 해부 하였다. ProtamineB-eGFP는 단백질은 이러한 초기 번데기 고환 (그림 6a 및 B)의 존재였다. 24 시간 후배양 r은 제어 정소 제 낭종이 HP 스위치 (도 6A ', 오픈 화살촉)를 넘어 개발 한 것으로 나타났다 ProtamineB-eGFP는 신호를 보여 주었다. 이것은 150 μM anacardic 산 (도 6B ')으로 처리 고환과 그렇지 않았다. 고환 스쿼시 준비 및 면역 형광 분석은 자세한 내용은 (그림 7)를 제공합니다. 미처리 제어에서, 상대적으로 큰 주 정모 세포의 핵은 주요 염색체 초파리 (도 7a, 1 열)의 (4C 레벨)에 해당 풍부한 스테인드 DNA의 세 영역의 패턴에 의해 그들의 특성을 인식 할 수있다. 히스톤 H4의 아세틸 화는이 단계 (그림 7B, 열 1)에서 명확하게 감지 할 수있다. 감수 분열 후 첫 단계 Nebenkern 스테이지라고하며 약간 큰 원형 핵 특징으로한다 (도 4C 참조,도 7에 도시되지). 도 7에 도시 된 다음 단계는 편모 성장과 이미 (도 7a, 칼럼 2) 초기 단계에서보다 훨씬 작으며 히스톤 H4 아세틸 거의 발견 할 수없는 수준으로 매우 낮음을 보여 생식 세포 핵의 라운드 형상으로 식별 (그림 7B, 2 열). 둥근 모양은 (그림 7A, 열 3)로 뻗어, 그리고 히스톤 H4의 아세틸 화는 분명히 다시 (그림 7B, 열 세) 검출이다. 정자는 HP 스위치가 일어나고 히스톤이 프로타민에 의해 대체되는 카누 모양의 단계에 도달 (도 7a - 7 C, 열 4와 5). 카누 스테이지에 이어 protaminated 핵은 더욱 성숙한 정자 (여기서는 도시하지 않음)에 아주 얇은 바늘 형상으로 신장.
anacardic 산 처리 고환의 고환 스쿼시 준비는 결과 (그림 다른 7D를 <보였다/ strong>을 - 7 F). anacardic 산 처리 생식 세포의 염색질은 더욱 미처리 컨트롤 (도 7D, 처리하고, 7A, 컨트롤과 비교)보다도 집광 나타났다. 면역 형광은 H4 아세틸 크게 감소 또는 anacardic 폰산 (도 7E)으로 처리 생식 세포의 핵에서조차 존재한다고 밝혀졌다 분석한다. 히스톤 아세틸 부족 염색질 영역 자주 억압 구조 (33)를 표시하는 동안 그것은 매우 아세틸 화 히스톤은 염색질의 영역과 연관된 것으로 알려져있다. 따라서 anacardic 산으로 처리가 처리 된 생식 세포의 핵 염색질 구조에 영향 것은 놀라운 일이 아니다. 중요한 것은, 후반 카누 단계 또는 외의 프로타민 양성 핵 취급 고환 (그림 7 층)에서 확인되지 않았다. spermiogenesis가 이리저리 진행에 따라서, 우리의 데이터는 생각과 일치하는 HAT 활동이 필수적이라고m의 프로타민 기반 크로 마틴 단계에 염색질을 히스톤 기반.
초파리 정자의 그림 1 개요. 왼쪽 패널은 개별 정자 줄기 세포에서 배아 세포 개발 단계의 순서를 표시합니다. 개략도는 생식 세포의 특성 핵 형태를 나타낸다. 하나 spermatogonium 하나 낭종 16 상호 정모 세포를 생산하기 위해 분할한다. 이 단계 이후 감수 개발에 필요한 성적 증명서의 대부분은 생산 병진 억압, 그리고 저장됩니다. 전사 활동의 대부분은 감수 분열에 항목으로 끝납니다. 염색질의 히스톤 - 투 - 프로타민 스위치는 초기와 후기 카누 단계 사이에 일어난 일입니다. 히스톤 기반의 크로 마틴과 단계가 높은빨간색 조명; 프로타민 기반의 크로 마틴과 단계가 녹색으로 강조 표시됩니다. 오른쪽 패널의 막대는 약 24에서 세균 일반적으로 애벌레의 개발 고환에서 찾을 수 있습니다 세포, 번데기의 단계와 번데기 형성 후 36 시간 (APF), 성인 파리를 나타냅니다.
개발의 다른 단계에서 2 초파리 고환 그림. (A) 세 번째 령 유충 (L3)의 약간 숙청 전체 마운트 고환의 위상 대비 이미지. 만 사전 감수 및 감수 단계를 찾을 수 있습니다. 정조 세포는 허브 지역 (별표) 아래의 앞쪽 끝으로 제한됩니다. 나머지 고환은 정모 세포 (오픈 화살표). (B) 약에 약간 찌그러 고환의 위상 대비 이미지로 가득 번데기 형성 (APF) 후 24 시간. 정모 세포 (오픈 화살표)뿐만 아니라, 고환 성장 편모 (더블 오픈 화살촉)와 단계 연신 라운드 핵과 정자와 Nebenkern 단계에서 정자 (오픈 화살촉을) 포함 (C - E). 표현 번데기 고환을 전체 마운트 H2AvD-RFP 및 ProtamineB-eGFP는 (위상차 및 eGFP는 및 RFP 형광 이미지의 오버레이). (C) 약 24 시간 APF에서 해부 번데기 고환. 화살촉은 약 36 시간 APF에서 해부 추정 지방 신체 세포. D) 번데기의 고환의 자동 형광 첫째 ProtamineB-eGFP는 양성 낭종 (화살표) 표시를 표시합니다. 약 48 시간의 APF에서 (E) 번데기의 고환을 그룹으로 ProtamineB-eGFP는 양성 낭종 (화살표). 모든 그림 부분에서 별표 허브 영역을 나타냅니다. 스케일 바 : 100 μm의.ANK ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
생체 성장 번데기 고환에서 히스톤 - 투 - 프로타민 ③ 스위치의 라이브 영상을 그림. (A) 번데기 형성 (APF) 후 약 45 시간에서 문화로 찍은 H2AvD-RFP 및 ProtamineB-eGFP는 표현 번데기 고환의 위상 대비 이미지. 정낭이 채워진 화살표로 표시됩니다. paragonium (더블 화살촉) 고환에 연결된 남아있다. (A ') (A)에 도시 된 고환의 eGFP는 및 RFP 형광. 오픈 화살표는 ProtamineB-eGFP는 양성 낭종을 나타냅니다. 스케일 바 :. 100 μm의 (B) 2 시간 문화에 30 분, 몇 가지 더 낭종 (오픈 화살표) 후 FR 등장OM 추가 캘리포니아 후 히스톤 간 전이 프로타민. (C) 문화에 3 시간, 즉, 문화의 5 시간 29 분의 총, 강한 ProtamineB-eGFP는 신호 낭종의 그룹 (오픈 화살표) 고환의 기단부에서 볼 수 있습니다. 또한 보충 비디오 1을 참조하십시오. 모든 그림 부분에서 별표 허브 영역을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
개발의 다른 단계에서 생식 세포의 격리 4 낭종 도표. (A) 낭종은 번데기 형성 (APF) 후 약 24 시간에 고환에서 해부. 위상차 및 H2AvD-RFP 형광 (적색) 이미지의 오버레이. 스케일 바 : 100 μm의.(B - E) 여러 단계의 단일 낭종의 배율. 미분 간섭 대비 (DIC) 및 RFP-H2AvD 형광 이미지의 오버레이. 스케일 바 :. 16 정모 세포의 20 μm의 (B) 낭종 Nebenkern 단계에서 64 라운드 정자의 (C) 낭종.. Nebenkern 구조는 다음 핵 (오픈 화살촉)에 융합 미토콘드리아에서 개발 및 DIC 이미지에 표시됩니다. 라운드 H2AvD-RFP 양성 핵 및 연신 편모를 가진 정자의 (D) 낭종 (오픈 화살촉이 함께 연신 Nebenkern 구조를 나타냅니다 성장 axoneme). (E) 연장 핵 모양을 보여주는 초기 카누 단계에서 정자의 낭종의 혀끝의 팁. 광범위하게 긴 편모는 부분적으로 만 볼 수 있습니다. 이 F의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오igure.
H2AvD-RFP를 표현하는 문화에 낭종의 감수 분열 I 생체. 형광 이미지를 시행 한 16 spermatocyte 낭종의 그림 5 라이브 영상. 낭종 파도 형상으로 감수 분열 통과에서 감수 분열 I. 정모 세포의 특징적인 단계는. 아르 나타낸 (A) 염색체 축합은 화살표로 나타낸 낭종 (방향을 (2) 낭종 일측 핵에서 시작 진행 ). 대향 영역의 핵 (1)은 세 개의 주요 염색체 마킹 히스톤 고밀도 영역이 여전히 식별 될 수 염색질 응축의 초기 단계를 나타낸다. 지역 정모 세포는 (2) 볼 밝은 형광 반점 완전히 응축 된 염색체가 포함되어 있습니다. (B) (30) 후0; 염색체 응축 영역 (1)에서 계속하면서 분, 지역에서 제 정모 세포 (2), telophase (오픈 화살촉)에 (C) 영역의 마지막 정모 세포 (1) 염색체 (화살촉)가 배치된다. 또 다른 15 분 이내 중기 판 20 분 이상이 필요합니다. (D)에서, 마지막 정모 세포는 telophase를 완료 한 것처럼 지금은 세포질 분열 (오픈 화살촉을)받을 준비가 된 것입니다. .도 보충 동영상이 눈금 막대를 참조하십시오. 50 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 Anacardic 산 배양 번데기 고환에서 히스톤 - 투 - 프로타민 스위치를 억제한다. 번데기 고환에게 expressi을 ((DMSO, 디메틸 설폭 사이드; 'A, 제어) 또는 150 μM anacardic 산으로 된 배지에서 NG H2AvD-RFP 및 ProtamineB-eGFP는과 번데기 형성 후 24 시간에서 해부 (APF)를 억제하지 않고 배지에서 24 시간 동안 배양 하였다 B, B '). 별표 (*)로 표시 허브 지역. (A, B) 아니오 ProtamineB-eGFP는 양성 낭종 절제술 후 관찰 할 수 없습니다. (A ') 배양 24 시간 후, 일부 낭종은 히스톤 - 투 - 프로타민 스위치와 ProtamineB-eGFP는 양성을 시행 anacardic 산 처리 낭종 (오픈 화살촉)을 관찰 할 수있다. (B ')를 고환 ProtamineB-eGFP는 양성 낭종을 개발하지 않습니다. 스케일 바 :. 100 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 7 Anacardic 산 히스톤 H4의 아세틸 화와 정자의 크로 마틴 구조에 영향을 미치는 번데기 고환에서 spermatid 핵 ProtamineB-eGFP는 표현 (24 시간 APF)의 억제제 (A - C)없이 24 시간 동안 배양의 스쿼시 준비를. 또는 150 μM anacardic 산 (D - F). DNA는 훽스트 염료 (A와 D)로 염색. H4 아세틸 (B 및 E) 분석 immunofluorescently. ProtamineB-eGFP는 신호 (C와 F)를 모니터링 프로타민의 존재. anacardic 산으로 처리 한 후, 강하게 염색질 (D) 및 압축 표시 H4 아세틸 신호는 완전히 모든 spermatid 단계 (E)에서 감소된다. 또한 anacardic-산은 처리고환은 후반 카누 단계 또는 외의 낭종없이 ProtamineB-eGFP는 신호 (F)를 표시하지 않습니다. 스케일 바 :. 10 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 1.6 시간 경시 이미징 생체. 비디오 성장 번데기 정소에서 eGFP는과 히스톤 투 프로타민 스위치 RFP 형광 통해 라이브 영상은 ProtamineB-의 보급 증가에 의한 히스톤 투 프로타민 천이를 도시 eGFP는 양성 낭종. 이미지는 매 5 분을 인수했다. 자세한 내용은 그림 3을 참조하십시오. (다운로드에서 "suppl_video_1.MOV"를 참조하십시오).
단일 16-정모 세포 낭종 진행 감수 분열의 보충 비디오 2 라이브 영상은 I 생체. 의 시간 경과 형광 이미징80 분에 걸쳐 H2AvD-RFP를 표현하는 문화에 낭종. 이 동영상은 감수 I. 이미지의 특성 단계마다 1 분을 취득한 보여줍니다. 자세한 내용은 그림 5를 참조하십시오. (다운로드에서 "suppl_video_2.MOV"를 참조하십시오).
Discussion
제시된 프로토콜은 특정 발달 단계에와 배양 접시에있는이 세포와 조직의 생체 개발에 초파리 고환 및 단일 배아 줄 낭종을 해부 할 수있는 능력에 모두 기반이 각 응용 프로그램에 대해 설명합니다. 하나의 응용 프로그램은 정자 개발하는 동안 중요한 프로세스의 약리 조작이다. 중요한 것은이 쉽게 비행 유전학을 기반 기능 분석을 사용하여 얻은되지 후 감수 정자에 액세스 할 수 있습니다. 다른 애플리케이션은 생활과 생식 세포 및 정소 개발 현미경 관찰이다. 특히 문화에 초파리 세포와 장기의 기능이 응용 프로그램의 이점은 생존하고 RT에서 정상적인 분위기에서 개발. 따라서, (25 ° C의 표준 사육 온도로 가열) 가열 단계가 장착 된 반전 영상 현미경 라이브 이미징 실험에서 의미있는 결과를 얻기에 충분하다. 또한라이브 이미징을위한 형광 단백질 태그 단백질을 표현하는 더 많은 유전자 변형 플라이 균주가 존재하거나 쉽게 설정할 수 있습니다.
특정 발달 단계의 번데기 고환 또는 세균 줄 낭종을 얻으려면, 그것은 하나가 초파리 개발의 타이밍을 잘 알고하는 것이 중요합니다. 각 단계에 대한 정확한 타이밍은 실험실 배양 조건에 따라 다양하고, 긴장을 비행 경험적으로 설정해야 할 수도 있습니다. 위에서 설명한 바와 같이, 이것은 예를 들면, HP 스위치를 대상으로, 약리학 분석에 특히 중요하다. 이러한 실험의 경우, 타이밍도 한 집단 내에서 약간 다를 수 있기 때문에 항상 실제 억제제 시험 전에 ProtamineB-eGFP는 신호 정자를 확인하는 것이 좋습니다.
첨부 된 지방이 신체 조직의 무료 그대로 장기 조기 번데기 단계에서 고환을 해부 실험을 가능하게해야 위의 프로토콜에 따라. 이 고환과, 더욱 더, GE의 격리RM 줄 낭종은 매우 약합니다. 그러므로, 취급 및 집게, 바늘 및 피펫을 이용하여 정소 낭종 및 전사에 필요한 손재주와 경험을 개발하는 것이 중요하다. 특히 감수 초 후 감수 생식 세포 발달을 목표로 연구는이 혜택을 누릴 것입니다. 그것은 성인 고환에서 긴 편모 늦은 정자의 낭종을 해부 비교적 쉽지만, 그것은 이전 스테이지를 얻기 어렵다. 이 프로토콜 다음과 같은 초기 번데기 고환에서 이러한 낭종을 해부하는 것은 훨씬 더 효율적입니다. 일반적인 비행 피로, 번데기 만 약 50 %가 남성 될 것 명심하십시오. 따라서, 필요한 고환의 수만큼 번데기 적어도 두번 해부 준비. 대안으로, 고환이 그대로 유충 3:23, 34의 좌우 지방 신체 조직에 매립 반투명 라운드 장기를 식별 할 수 있으므로, 입체 현미경을 사용하여 남성 L3 유충을 식별하기, 및 신선한 배양 병에 그들을 수집 할 수 있음 수준비 및 해부에 대한 사전 번데기를 선택하는 데 사용 될 수있다. 이는 남성 미리 35 번데기를 식별하는 것도 가능하다.
이전에 18에보고 된 바와 같이 우리는 격리 된 세균 줄 낭종과 문화에서 그대로 번데기 고환이 모두 빛에 민감한 것으로 나타났습니다. 이 빛이 감도는 약물 학적 분석에 사용되는 일부 화학 물질에 대한 유지 수 있습니다. 따라서, 배양 동안 어둠 속에서 분석의 배양 접시를 유지하는 것이 가장 좋습니다. 개발 고환과 함께 시간 경과 이미징 실험을 계획 할 때 마찬가지로, 특히, 절연 낭종은 너무 긴 노출 시간 및 / 또는 너무 높은 샘플링 속도가 생체 개발을 억제 할 수 있습니다 점에 유의하십시오. 적절한 샘플링 레이트는 실험적으로 결정되어야한다.
배양 접시에서 세균 및 / 또는 곰팡이 감염 이상 성장은 심각한 문제가있다. 너무 많은 세균에 감염된 배양 접시는 생체에는 Deve을 지원하지 않습니다고환 및 낭종의 lopment. 따라서, 설명 된 배지 페니실린 및 스트렙토 마이신 (단계 1.1 참조)하지만, 장기 배양 중에 포함 이러한 항생제는 저하 될 수 있으며 그들의 활성을 감소 것이다. 이는 생존 기간 한정 이유 중 하나 (최대. 72 시간) 상기 프로토콜을 사용하여 관찰 할 때 배양 낭종 수 있었다. 그러나이 시간 프레임은 요리 배지 정규 교환에 의해 확장 될 수 없었다. 우리는 다른 요소는 생식기의 다른 조직에서 성장 신호들의 부족으로, 배양 생존에 영향을 미칠 수 있음을 결론 지었다. 한편, 이후의 개발이 빠르게 감수 초파리 포유류보다. 초파리에서 spermiogenesis은 약 90 시간 소요되며, HP 스위치는 감수 분열 9,12 후 50 ~ 60 시간 사이에 일어난 일입니다. 따라서이 프로토콜을 구현할 약 48 시간의 통상의 생존 시간은 SPE에 피봇 발생 과정을 수행하기 위해 적합같은 감수 분열 또는 HP의 스위치로 rmatogenesis. 세균 또는 진균의 오염이 깨끗 툴과 미디어를 사용함으로써 회피 될 수 있지만, 제시된 프로토콜은 파리 때문에 엄격히 무균 작업 조건을 사용하고 표준 조건 하에서 발생하는 경우 정소 이미 박테리아를 포함하는 비행하지 않는다. 그럼에도 불구하고,이 문화 기술의 일부 응용 프로그램은 해부 파리 혜택을 누릴 수 있습니다 또는 (프로토콜, 17,36,37 참조) 무균 조건에서 발생합니다.
약리 분석법 억제제 또는 각종 효소의 활성화 제로서 작용하는 화학적 화합물의 용도에 따라 다르다. 일반적으로 그러한 실험에 사용 된 화합물은 종종 타겟 특이성에 크게 다르다. 이점으로서,이 산 anacardic 억지 P300 / CBP, PCAF,와 모자 (38)의 MYST 가족 구성원, 예를 들어, 전체 효소 클래스를 타겟팅 할 수있는 잠재력을 제공한다. 이 방법의 단점은 오프 대상 또는 세포 독성 효과 INDUC 잠재력이 될 수이러한 화합물에 의해 에드. 따라서, 번데기 고환 또는 낭종 분석에 사용 된 각 화합물은 세포 독성 및 다른 농도에서 특정 효과를 테스트해야합니다. 또한, 배양 조건, 화합물 농도 또는 활성 및 세포 투과도의 변화에 약간의 차이가 유도 효과의 변동을 초래할 수있다. 따라서, 각각의 실험에서 치료 성공을 모니터링하는 것이 필요하다. 우리가 150 μM에서 anacardic 산을 사용할 경우 히스톤 H4 아세틸 지속적으로 감소하면서 예를 들어, 우리는 간 때로는 약간 고환 내의 염색질 응축 표현형의 강도에 약간의 변화를 관찰했다.
배양 초파리 고환과 약리 분석법은 정자 4,12,14,21의 전후 감수 기전을 분석하기 위해 사용되어왔다. 이 유전자 도구 후 감수 정자에 액세스 할 수 어렵 기 때문에 된 essentia와 선수를 대상으로합니다L 개의 사전 감수 및 감수 기능이 생체 외 접근법은 대안을 구성한다. 또한, 원칙적으로, 상기 방법은 시간이 지남에 따라 처리 된 생식 세포의 발달을 따라 실험 - 펄스 추적하도록 구성 될 수있다. 그러나, 우리는 아직이 가능성을 시험하지 않았다. 초기 번데기 고환을 사용하는 것은 약물 분석의 장점이다. 첫째, (24 시간 APF 정도) 젊은 번데기 고환의 얇은 외피는 화학 물질의 개선 투자율을 허용 할 수 있습니다. 포스트 감수 HP 스위치를 공부 둘째, 번데기 고환은 HP 스위치가 영향을 받거나되었는지 여부의 직접 판독을 가능하게 프로타민-GFP 발현 플라이 라인에서 24 시간 APF에서 해부.
현재까지, 초파리 기관, 고환 및 생식 - 라인 낭종을 포함한 조직의 생체 외 배양을위한 여러 프로토콜 (예 4,14,17,20,39,40 참조)이 개발되었다. 재배 매체에 사용되는 일반 조건1979 년에 설립되었다 여기에 제시된 프로토콜 17. 문화 시스템은 나중에 성인 고환 사에서 분리 후반 이후 감수 낭종의 개별화기구의 생체 내 이미징에 적응했다. 이전에, 우리는 이러한 조건이 또한 주위에 48 시간 12 그들의 낭종에서 생존과 감수 초 후 감수 생식 세포의 분화를 지원한다고합니다. 다른 문화 시스템 (19)과는 대조적으로이 문화에서 관찰 발달시기 (자세한 내용은 12 참조) 고정 된 샘플에서 결정 타이밍에 대략 일치했다. H2AvD-RFP 및 프로타민-GFP 형광 신호는 배양 생식 세포의 핵 염색질 형태 및 조성물을 시각화 할 수있다. 우리는 문화의 발달 단계의 명확한 식별을 위해이 같은 낭종의 코일과 같은 다른 기준 유리한 것으로 나타났습니다. 중요한 것은, 제시된 프로토콜은 플라이 EXT의 첨가를 포함하지 않는다소 태아 혈청 이외 RACT 또는 다른 성장 인자. 또한, 우리는 조건이 체외 문화 감수 분열의 형광 현미경 영상과 호환되는지 여기 보여준다. 이미지는 장기 발전을 지원하기 편한 매체 적당한 해상도를 얻을 수있다. 이것은 Voltalef 오일 41,42에서 단기 (약 3 시간)의 관찰을 가능하게하는 프로토콜 대조적이다.
재배 및 번데기 고환 및 단일 남성 생식 세포 낭종의 약물 치료를 위해 위에서 설명한 절차는 초파리의 정자에서 연구 할 수있는 많은 유전, 후성 유전 학적, 생물학적 세포, 또는 발달 질문에 쉽게 적응할 수 있습니다. 이 세균 온라인 줄기 세포에 초점을 맞추고, 특히 연구를 포함한다. 그것은 배양 성인의 라이브 영상 다음에 할 수있는 줄기 세포 개발이 20,43를 고환 보였다. 그러나, 성숙한 정소의 연동 운동 수렁시간은 이미지 수집 방해합니다. 따라서, 어느 촬상 단편화 고환 43 또는 실시 이미징 실험의 수는 손실 된 데이터 집합 (20)을 설명하기 위해 증가되어야한다을 사용하여 수행된다. 초기 번데기 고환 (24 시간 APF)는 아직 근육 세포에 동봉되어 있지 않습니다. 조금이라도 나이가 고환 (36-45 시간의 APF)은 몇 연동 움직임을 보여줍니다 (그림 3 및 보충 비디오 비교 1) 나타납니다. 따라서, 그대로 장기 어린 번데기 고환의 재배가 대안이 될 수있다.
또한, 한 번, 번데기 고환을 해부 할 수있는 능력을 숙달 결국 고립 세균 줄 낭종은 작은 세포 집단이기는하지만 동종의 소스로 단일 낭종을 사용하여 추가 응용 프로그램을 수 있습니다. 이미 증명 된 바와 같이 예를 들어, 그것은, 정자의 정의 단계 동안에 특정 유전자의 전사 조절을 분석하기 위해 RT-qPCR에 수행하는 것이 가능하다
Disclosures
저자는 경쟁의 이익이 없다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anacardic acid | Merck Millipore | 172050 | brand: Calbiochem (EMD Millipore) |
| Anti-acetyl-Histone H4 | Merck Millipore | 06-598 | brand: Upstate |
| AxioCam MRm | Zeiss | ||
| AxioObserver.Z1 inverted microscope | Zeiss | ||
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Dumont 5-Inox forceps | Dumont | multiple suppliers | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Sigma | F4135 | |
| Fiber optical illuminator | multiple suppliers | ||
| Glass Bottom Microwell Dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)-Cy5 | Dianova | 711-175-152 | |
| Hoechst | Sigma | B1155 | |
| Inoculation loop or pin holder | multiple suppliers | ||
| Austerlitz INSECT PINS stainless steel needles, size 0 | Plano GmbH | N5018 | In our hands both of these pin sizes worked well in the dissections. The minutiens are less rigid but have a smaller tip diameter. |
| Austerlitz INSECT PINS stainless steel minutiens, diam. 0.1 mm | Plano GmbH | N5014 | |
| Multiwell plates, 24-wells | Becton Dickinson | 351147 | brand: Falcon |
| Pen Strep | invitrogen | 15070 | brand: Gibco |
| Shields and Sang M3 Insect Medium | Sigma | S8398 | |
| Stemi SV6 binocular | Zeiss |
References
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