استخدام لل<em> فيفو السابقين</em> جهاز تشاندلر حلقة لتقييم توافق مع الحياة من التعديل أنابيب الدم البوليمرية
Summary
Blood exposure to polymeric blood conduits initiates the foreign body reaction that has been implicated in clinical complications. Here, the Chandler Loop Apparatus, an experimental tool mimicking blood perfusion through these conduits, is described. Appendage of recombinant CD47 results in decreased evidence of the foreign body reaction on these conduits.
Abstract
يحدث رد فعل جسم غريب عند تقديم سطح الاصطناعية للجسم. يتميز امتصاص البروتينات في الدم والمرفق اللاحق وتفعيل الصفائح الدموية، الوحيدات / التصاق البلاعم والخلايا الأحداث يشير التهابات، مما يؤدي إلى مضاعفات ما بعد الإجرائية. جهاز تشاندلر حلقة هو نظام التجريبية التي تسمح للباحثين لدراسة التفاعلات الجزيئية والخلوية التي تحدث عند و perfused كميات كبيرة من الدم خلال قنوات البوليمرية. تحقيقا لهذه الغاية، وقد استخدم هذا الجهاز لتكون نموذجا فيفو السابقين السماح تقييم خصائص مضادة للالتهابات من مختلف التعديلات سطح البوليمر. وقد أظهرت مختبرنا أن قنوات الدم، تعديل تساهميا عبر الكيمياء تنشيط ضوئي مع CD47 المؤتلف، يمكن أن تمنح توافق مع الحياة على الأسطح البوليمرية. يمكن إلحاق CD47 على الأسطح البوليمرية تكون وسيلة فعالة لتعزيز فعالية قنوات الدم البوليمرية. لهاعين هي المنهجية التي تفصل الكيمياء تنشيط ضوئي يستخدم لإلحاق CD47 المؤتلف إلى قنوات الدم البوليمرية ذات الصلة سريريا واستخدام تشاندلر حلقة كنموذج خارج الحي التجريبي لدراسة التفاعلات الدم مع CD47 تعديل وسيطرة القنوات.
Introduction
تتطلب العديد من الإجراءات السريرية، مثل تغيير شرايين القلب وغسيل الكلى، واستخدام قنوات الدم البوليمرية، وغالبا ما يترافق مع مضاعفات ما بعد الإجرائية 1. عندما مع perfused الدم، وهذه البوليمرات غير المشروع رد فعل جسم غريب (FBR)، مما أدى إلى امتصاص البروتينات في الدم والصفائح الدموية، الوحيدات / التصاق البلاعم، وإطلاق سراح السيتوكينات الموالية للالتهابات، وكلها تساهم مضاعفات ما بعد الإجرائية و / أو فشل الجهاز 2،3. وبالتالي، لا تزال استراتيجيات لمعالجة هذه المسألة مجالا هاما والمستمرة لبحوث المواد الحيوية. وقد حاول الباحثون لمعالجة هذه المشكلة عن طريق تعديل الدم الاتصال مع الأسطح النشطة بيولوجيا الجزيئات أو bioinert 4-6. وقد ركزت البحوث في المختبر لدينا على إلحاق CD47 المؤتلف (recCD47) إلى المواد الحيوية البوليمرية كاستراتيجية للتخفيف من FBR وزيادة فعالية هذه المواد. CD47 هو transmembr أعرب بتواجد مطلقالبروتين انو مع دور المعروفة في التهرب المناعي، منح صفة "الأنا" على التعبير عن خلايا 7-10 والعروض نعد في منح توافق مع الحياة عندما إلحاق السطوح البوليمرية 11-13. ، وأعرب عن إشارة التنظيمية بروتين ألفا (SIRPα)، وما شابه ذلك لمستقبلات CD47، وعضوا في عزر مثبط التيروزين استنادا-immunoreceptor (ITIM) المحتوية عائلة من البروتينات عبر الغشاء على خلايا المنشأ النخاعي 14. لقد أثبتنا سابقا أن CD47، عبر SIRPα بوساطة إشارات الخلية، بانخفاض ينظم-الاستجابات المناعية لالبولي يوريثان (PU) والبولي فينيل كلورايد (PVC) في في المختبر، خارج الحي، ونماذج في الجسم الحي 11-13.
المركزي للتحقيقات لدينا هو الكيمياء تنشيط ضوئي جديد نسبيا، الموصوفة هنا، في أي المجموعات ثيول رد الفعل كيميائيا يتم إلحاق تساهميا لأنابيب البوليمرية بتفاعل مع أنابيب البوليمر متعدد الوظائف (PDT بيسةفتاه)، تتألف من 2 pyridyldithio (PDT)، وبينزفينون photoreactive (BzPh) وpolyallylamine المعدلة كربوكسي 11-13. الحد المجموعات PDT إلحاق تساهميا مع تريس (2 carboxyethyl) الفوسفين هيدروكلوريد (TCEP) 11 غلة سطح thiolated التي يمكن أن تكون في وقت لاحق مع رد فعل الأنصاف العلاجية. وسبق تفصيله هنا 12،13، وكان رد فعل recCD47، مما تعديل مع إضافة بولي ذيل يسين-C محطة 12،13، مع Sulfosuccinimidyl-4- [N -maleimidomethyl] الهكسان الحلقي-1-الكربوكسيل (سلفو-SMCC) لمدة 1 ساعة لتوليد مجموعات ثيول رد الفعل، والسماح لتشكيل السندات monosulfide بين أنابيب وrecCD47 11. تم اختبار القدرة المضادة للالتهابات من السطوح CD47 بين functionalized، بحكم فيف س، وذلك باستخدام جهاز تشاندلر حلقة مع الدم البشري كله، الذي وصف في الأصل في عام 1958 لتكون نموذجا في المختبر من التخثر الخثاري 15. ويعتمد الجهاز علىنظام أنابيب مغلقة مملوءة جزئيا مع الهواء ومحرك دوار تعميم الدم عبر أنابيب 15. يوفر هذا النموذج التجريبي الفرصة لدراسة تأثير التعرض الدم على أسطح المعدلة وغير المعدلة وكذلك تأثير تلك التعديلات السطحية على علم وظائف الأعضاء من خلايا الدم.
recCD47 يمكن إلحاق مجموعة متنوعة من السطوح البوليمرية باستخدام هذه الكيمياء تنشيط ضوئي، ويمكن تقييم قدرتها المضادة للالتهابات من خلال الاستفادة من فيفو السابقين نموذج محاكاة ذات الصلة سريريا نضح الدم فوق السطوح البوليمرية 11،12. السريرية قنوات الدم تعديل درجة مع recCD47 تظهر أقل بكثير الصفائح الدموية والتهاب مرفق الخلية بالمقارنة مع البوليمرات غير معدلة عند التعرض للدم البشري في الجهاز. ووصف بالتفصيل خطوة بخطوة من هذه العملية تعديل أدناه.
Protocol
Representative Results
Discussion
الكيمياء تنشيط ضوئي (ملخصة في الشكل 1) يسمح لتعديل أي سطح تقريبا البوليمر التي تحتوي الهيدروكربونات كافية لتسهيل PDT-BzPh التعلق واللاحقة الأشعة فوق البنفسجية إلى الصور تفعيل PDT-BzPh. Functionalizing سطح البوليمر مع جماعات ثيول تفاعلية تسمح للمرفق لاحق مجموعة من جزيئات ق…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Thermo Scientific | 58906 | Caution! Use in fume hood |
| 25% Glutaraldehyde | VWR | AAA17876-AP | Caution! Use in fume hood |
| 2-pyridyldithio,benzophenone (PDT-BzPH) | Synthesized in lab | N/A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A3059-100G | |
| Citrate | Sigma | S5770-50ML | |
| Digital Camera | Leica | DC500 | Out of production |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | 270547-100ML | Caution! Use in fume hood |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco/Life Technologies | 14190-136 | |
| Fluorescent Microscope | Nikon | TE300 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Scientific | A38-212 | Caution! Use in fume hood |
| Human CD47 (B6H12) – FITC Antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-12730 | |
| Osmium Tetroxide | Acros Organics | 197450050 | Caution! Use in fume hood |
| Potassium Bicarbonate (KHCO3) | Sigma | 237205-100G | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655-100G | |
| PVC Tubing (Cardiovascular Procedure Kit) | Terumo Cardiovascular Systems | 60050 | Most clinical-grade tubing will work |
| Scanning Electron Microscope | JEOL | JSM-T330A | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | Spectramax Gemini EM | |
| Sulfo-SMCC | Sigma | M6035-10MG | Moisture Sensitive! |
| tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP-HCl) | Thermo Scientific | 20491 | |
| Tris Base | Sigma | T1503-100G | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531 | |
| Vectashield with DAPI | Fisher Scientific | H-1200 | Light sensitive! |
| Zeba Spin Desalt Columns – 7K MWCO | Thermo Scientific | 89891 |
Riferimenti
- Bruck, S. D. Medical applications of polymeric materials. Med. Prog. Technol. 9 (1), 1-16 (1982).
- Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Semin. Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).
- Levy, J. H., Tanaka, K. A. Inflammatory response to cardiopulmonary bypass. Ann. Thorac. Surg. 75, S715-S720 (2003).
- Sperling, C., Maitz, M. F., Talkenberger, S., Gouzy, M. F., Groth, T., Werner, C. In vitro blood reactivity to hydroxylated and non-hydroxylated polymer surfaces. Biomaterials. 28, 3617-3625 (2007).
- Sperling, C., Schweiss, R. B., Streller, U., Werner, C. In vitro hemocompatibility of self-assembled monolayers displaying various functional groups. Biomaterials. 26, 6547-6457 (2005).
- Vasita, R., Shanmugam, I. K., Katt, D. S. Improved biomaterials for tissue engineering applications: surface modification of polymers. Curr. Top. Med. Chem. 8, 341-353 (2008).
- Subramanian, S., Parthasarathy, R., Sen, S., Boder, E. T., Discher, D. E. Species- and cell type-specific interactions between CD47 and human SIRPalpha. Blood. 107 (6), 2548-2556 (2006).
- Tsai, R. K., Discher, D. E. Inhibition of ‘self’ engulfment through deactivation of myosin-II at the phagocytic synapse between human cells. J Cell Biol. 180 (5), 989-1003 (2008).
- Berg, T. K., vander Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends Immunol. 29 (5), 203-206 (2008).
- Oldenborg, P. A., Zheleznyak, A., Fang, Y. F., Lagenaur, C. F., Gresham, H. D., Lindberg, F. P. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).
- Stachelek, S. J., et al. The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation. Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2001).
- Finley, M. J., Rauva, L., Alferiev, I. S., Weisel, J. W., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces. Biomaterials. 33, 5803-5811 (2012).
- Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces. Biomaterials. 34, 8640-8649 (2013).
- Ravetch, J. V., Lanier, L. L. Immune inhibitory receptors. Science. 290, 84-89 (2000).
- Chandler, A. B. In vitro thrombotic coagulation of blood: a method for producing a thrombus. Lab Invest. 7, 110-114 (1958).
- Thorsen, T., Klausen, H., Lie, R. T., Holmsen, H. Bubble-induced aggregation of platelets: effects of gas species, proteins, and decompression. Undersea Hyperb Med. 20 (2), 101-119 (1993).
- Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platlet accumulations around “air bubbles” in blood after venous air embolism. Intl J of Legal Med. 111 (1), 22-26 (1998).
- Miller, R., Fainerman, V. B., Wüstneck, R., Krägel, J., Trukhin, D. V. Characterization of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques. Colloids and Surfaces A. 131 (1-3), 225-230 (1998).
- Oeveren, W. V., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. Int J Biomater. 2012, (2012).
