L'utilisation de l'<em> Ex Vivo</em> Chandler boucle Appareil pour évaluer la biocompatibilité des conduits de sang polymères modifiés
Summary
Blood exposure to polymeric blood conduits initiates the foreign body reaction that has been implicated in clinical complications. Here, the Chandler Loop Apparatus, an experimental tool mimicking blood perfusion through these conduits, is described. Appendage of recombinant CD47 results in decreased evidence of the foreign body reaction on these conduits.
Abstract
La réaction de corps étranger se produit lorsqu'une surface synthétique est introduit dans le corps. Il est caractérisé par l'adsorption de protéines du sang et la fixation subséquente et l'activation des plaquettes, des monocytes / macrophages adhérence, et les événements de signalisation des cellules inflammatoires, ce qui conduit à des complications post-procédure. L'Appareil Chandler Loop est un système expérimental qui permet aux chercheurs d'étudier les interactions moléculaires et cellulaires qui se produisent lorsque de grandes quantités de sang sont perfusés sur des conduites polymériques. A cet effet, ce dispositif a été utilisé comme un modèle ex vivo permettant d'évaluer les propriétés anti-inflammatoires des différentes modifications de surface polymère. Notre laboratoire a montré que les conduits sanguins, modifiées de façon covalente par photoactivation chimie avec CD47 recombinant, peuvent conférer à la biocompatibilité des surfaces polymères. L'ajout de CD47 sur des surfaces polymères pourrait être un moyen efficace de promouvoir l'efficacité de conduits sanguins polymères. Sonein est la méthodologie en détail la chimie de photoactivation utilisé pour ajouter CD47 recombinant à des conduits sanguins cliniquement pertinentes polymères et l'utilisation de la boucle de Chandler comme un modèle expérimental ex vivo pour étudier les interactions de sang avec le CD47 modifiée et de contrôle des conduits.
Introduction
De nombreuses procédures cliniques, tels que la circulation extracorporelle et de dialyse rénale, nécessitent l'utilisation de conduits sanguins polymères et sont souvent associés à des complications post-procédure 1. Lorsque perfusé avec du sang, ces polymères illicite la réaction de corps étranger (FBR), résultant en adsorption des protéines et des plaquettes sanguines, des monocytes / macrophages adhérence, et la libération de cytokines pro-inflammatoires, qui contribuent tous complications post-procédure et / ou défaillance de l'appareil 2,3. Ainsi, les stratégies pour résoudre ce problème restent un domaine important et continu de recherche sur les biomatériaux. Les enquêteurs ont tenté de résoudre ce problème en modifiant les surfaces en contact avec le sang ou bioactifs bioinertes molécules 4-6. Recherche dans notre laboratoire a mis l'accent sur l'ajout de CD47 recombinant (recCD47) de biomatériaux polymères comme une stratégie pour atténuer la FBR et augmenter l'efficacité de ces matériaux. CD47 est un transmembr exprimée de manière ubiquitaireprotéine ane avec un rôle connu dans l'évasion immunitaire, conférant le statut de «soi» sur des cellules exprimant 7-10 et présente des résultats prometteurs à conférer biocompatibilité lorsqu'elle se rapporte à des surfaces polymères 11-13. Signal alpha-protéine de régulation (SIRPα), le récepteur apparenté pour le CD47, et un élément de motif d'inhibition à base de tyrosine d'immunorécepteur (ITIM) contenant famille de protéines transmembranaires, est exprimé sur les cellules d'origine myéloïde 14. Nous avons précédemment démontré que CD47, par l'intermédiaire de la signalisation cellulaire médiée par SIRPα, régule à la baisse les réponses immunitaires à de polyuréthane (PU) et le chlorure de polyvinyle (PVC) dans in vitro, ex vivo et in vivo dans des modèles de 11 à 13.
Au cœur de nos enquêtes est relativement nouveau en chimie des photoactivation, décrit ici, dans lequel les groupes thiol chimiquement réactifs sont ajoutés de manière covalente à un tube polymère en faisant réagir le tube avec un polymère multifonctionnel (PDT-BzPh), composée de 2-pyridyldithio (PDT), la benzophénone photo-réactif (BzPh) et une polyallylamine carboxy modifié 11-13. La réduction des groupes PDT annexés covalente avec le tris (2-carboxyéthyl) phosphine chlorhydrate (TCEP) 11 donne une surface thiolé qui peut être ensuite mis à réagir avec des fragments thérapeutiques. Détaillées ici précédemment et 12,13, recCD47, en outre modifié par l'addition d'une queue poly-lysine C-terminal 12,13, est mis à réagir avec le sulfosuccinimidyl-4-[N -maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC) pendant 1 heure pour produire des groupes thiol réactifs, ce qui permet une formation d'une liaison entre le tube monosulfure et recCD47 11. La capacité anti-inflammatoire des surfaces CD47 fonctionnalisés a été testé, ex viv o, en utilisant l'appareil Chandler boucle avec du sang humain total, qui a été décrite à l'origine en 1958 comme un modèle in vitro de la coagulation thrombotique 15. L'appareil repose sur unSystème de tube fermé partiellement rempli d'air et un moteur rotatif pour faire circuler le sang à travers la tubulure 15. Ce modèle expérimental offre la possibilité d'étudier l'effet de l'exposition du sang à des surfaces modifiés et non modifiés, ainsi que l'effet de ces modifications de surface sur la physiologie des cellules du sang.
recCD47 peut être ajouté à une variété de surfaces de polymères à l'aide de cette chimie de photoactivation, et sa capacité anti-inflammatoire peut être évaluée en utilisant un modèle ex vivo cliniquement pertinente imitant la perfusion sanguine sur des surfaces polymériques 11,12. Grade clinique conduits sanguins modifiés avec recCD47 montrent nettement moins plaquettaire et la fixation des cellules inflammatoires par comparaison à des polymères non modifiés lors d'une exposition à du sang humain dans le dispositif. Une description étape par étape de ce processus de modification est détaillée ci-dessous.
Protocol
Representative Results
Discussion
La chimie de photoactivation (résumé à la figure 1) permet la modification de pratiquement n'importe quelle surface du polymère qui a des hydrocarbures suffisantes pour faciliter PDT-BzPh fixation et l'irradiation UV subséquente de photo-activer la PDT-BzPh. La fonctionnalisation de la surface polymère avec des groupes thiol réactifs permet la fixation ultérieure de toute une série de molécules d'intérêt testables. Dans nos études particulières, nous avons choisi recombinant CD…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Thermo Scientific | 58906 | Caution! Use in fume hood |
| 25% Glutaraldehyde | VWR | AAA17876-AP | Caution! Use in fume hood |
| 2-pyridyldithio,benzophenone (PDT-BzPH) | Synthesized in lab | N/A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A3059-100G | |
| Citrate | Sigma | S5770-50ML | |
| Digital Camera | Leica | DC500 | Out of production |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | 270547-100ML | Caution! Use in fume hood |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco/Life Technologies | 14190-136 | |
| Fluorescent Microscope | Nikon | TE300 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Scientific | A38-212 | Caution! Use in fume hood |
| Human CD47 (B6H12) – FITC Antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-12730 | |
| Osmium Tetroxide | Acros Organics | 197450050 | Caution! Use in fume hood |
| Potassium Bicarbonate (KHCO3) | Sigma | 237205-100G | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655-100G | |
| PVC Tubing (Cardiovascular Procedure Kit) | Terumo Cardiovascular Systems | 60050 | Most clinical-grade tubing will work |
| Scanning Electron Microscope | JEOL | JSM-T330A | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | Spectramax Gemini EM | |
| Sulfo-SMCC | Sigma | M6035-10MG | Moisture Sensitive! |
| tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP-HCl) | Thermo Scientific | 20491 | |
| Tris Base | Sigma | T1503-100G | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531 | |
| Vectashield with DAPI | Fisher Scientific | H-1200 | Light sensitive! |
| Zeba Spin Desalt Columns – 7K MWCO | Thermo Scientific | 89891 |
Riferimenti
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