Introduction
Optagelsen og fordeling af næringsstoffer og giftstoffer kraftig indflydelse plantevækst. Derfor undersøgelse af underliggende transportprocesser udgør en væsentlig forskningsområde i plantebiologi og jordbrugsvidenskab 1,2, især i de kontekster ernæringsmæssige optimering og miljømæssige belastninger (fx salt stress, ammonium toksicitet). Blandt metoderne til måling af flux i planter er brugen af radioisotopiske sporstoffer, som blev udviklet betydeligt i 1950'erne (se f.eks, 3) og fortsætter med at være meget udbredt i dag. Andre metoder, såsom måling af næringsstof udtømning fra roden mediet og / eller akkumulering i væv, anvendelse af ion-selektive vibrerende mikroelektroder såsom MIFE (mikroelektrode ionstrøm estimation) og SIET (scanning ionselektiv elektrode teknik), og anvendelse af ion-selektive fluorescerende farvestoffer er også udbredt, men er begrænsede i deres evne til at detektere netto influenzaxes (dvs. forskellen mellem tilstrømning og udstrømning). Anvendelse af radioisotoper, på den anden side gør det muligt for forskeren enestående evne til at isolere og kvantificere ensrettede strømme, som kan anvendes til at løse kinetiske parametre (fx K M og Vmax), og give indsigt i kapacitet, energetik, mekanismer og regulering, af transportsystemer. Ensrettede flux målinger foretaget med radioaktive sporstoffer er især nyttige under betingelser, hvor fluxen i den modsatte retning er høj, og omsætningen af intracellulære puljer er hurtig 4. Desuden radiotracer metoder tillader målinger skal udføres i henhold til forholdsvis høje substratkoncentrationer, i modsætning til mange andre teknikker (se "Diskussion", nedenfor), fordi den spores isotop observeres på baggrund af en anden isotop af det samme element.
Her giver vi detaljerede trin for radioisotopisk måling af ensrettet og nET flux mineralske næringsstoffer og giftstoffer i intakte planter. Der vil blive foretaget på flux måling af kalium (K +), en plante makronæringsstoffer 5, og ammoniak / ammonium (NH3 / NH4 +), en anden makronæringsstoffer som er imidlertid toksiske, når til stede i høje koncentrationer (f.eks 1- 10 mM) 2. Vi vil anvende radioisotoper 42 K + (t 1/2 = 12,36 timer) og 13 NH 3/13 NH4 + (t 1/2 = 9.98 min), henholdsvis i intakte planter af modelsystemet byg (Hordeum vulgare L .), i beskrivelsen af to centrale protokoller: direkte tilstrømning (DI) og kompartment analyse af sporstof udstrømning (CATE). Vi bør bemærke fra starten, at denne artikel beskriver blot de er nødvendige for at udføre hver protokol. Hvor det er relevant, korte forklaringer af, beregninger og teori forudsat, men detaljerede fremstillinger af hver teknik'S baggrund og teori kan findes i flere vigtige artikler om emnet 4,6-9. Vigtigere er det, disse protokoller er stort set overføres til flux analyse af andre næringsstoffer / giftstoffer (f.eks 24 Na +, 22 Na +, 86 Rb +, 13 NO 3 -) og til andre plantearter, omend med et par protester (se nedenfor) . Vi understreger også betydningen af, at alle forskere, der arbejder med radioaktive materialer skal arbejde under en licens arrangeret gennem deres institutions ioniserende stråling sikkerhed regulator.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plant Kultur og Forberedelse
- Grow bygkimplanter hydroponically 7 dage i et klima-kontrolleret vækst kammer (for detaljer, se 10).
BEMÆRK: Det er vigtigt at overveje at vurdere planter på en række udviklingsstadier, da næringsstoffer krav vil ændre sig med alderen. - En dag før eksperimenteren bundte flere kimplanter sammen til en enkelt replikat (3 planter pr bundt for DI, 6 planter pr bundt for CATE). Bundle kimplanter efter indpakning en 2 cm stykke Tygon slange omkring den basale del af skuddene, og sikre slangen med tape for at skabe en "krave".
BEMÆRK: Antallet af planter pr bundt kan variere baseret på eksperimentelle betingelser 10,13,14. Bundling er gjort for at forbedre statistikkerne og målenøjagtighed, især når rodmassen og / eller specifik aktivitet er lav.
2. Udarbejdelse af Eksperimentelle Solutions / Materialer
indhold "> BEMÆRK: Følgende udføres typisk 1 dag før eksperimenteren.- For DI indsamle følgende: Pre-etikettering, mærkning og desorption løsninger (for detaljer, se 11), centrifugering rør (til spin-tørring af plante prøver), og prøvehætteglas (for plantemateriale og specifik aktivitet [S o; se nedenfor]). Luftes og bland alle løsninger.
- For CATE indsamle følgende: velblandet, porebeton mærkning og elueringsbetingelserne løsninger (for detaljer, se 10), efflux skorstene, centrifugering rør (til spin-tørring af plante prøver) og prøvehætteglas (for eluater, plante prøver, og bestemmelse af S o og fortyndingsfaktoren [D f, se nedenfor]).
3. Forbered radiotracer
ADVARSEL: Der skal træffes følgende sikkerhedsforanstaltninger skridt forud for at arbejde med radioaktivitet.
- Sørg for, at kravene i radioactive materialer licens forstås og følges. Anvend passende sikkerhedsudstyr (dvs. beskyttelsesbriller, handsker, kittel, bly vest / krave) og dosimetre (f.eks TLD ringen og badge). Opsæt afskærmning (dvs. plexiglas og bly klodser) og udfører radioaktiv arbejde bag det. Sørg for, at en Geiger-Müller tæller er til stede for at rutinemæssigt overvåge forurening.
- Fremstilling af 42 K +
- Placer en ren, tør bæger på vægten. Nul balance.
- Fjern hætteglas med sporstof (20 mCi 42 K 2 CO 3, i pulverform) fra emballage og hæld sporstof i bægerglasset. Vær opmærksom på massen.
- Pipetter 19.93 ml dH2O, efterfulgt af 0,07 ml H 2 SO 4, ned i bægerglasset. Dette vil føre følgende kemiske reaktion:
42 K 2 CO 3 (R) + H 2 SO 4 (l) + H2O (l) → 42 2 SO 4 (L) + CO 2 (v) + 2H 2 O (l) - Beregn koncentrationen af den radioaktive stamopløsning, eftersom massen og molekylvægten af K 2 CO 3, og den mængde (20 ml).
BEMÆRK: Hvis du arbejder med 13 NH 3/13 NH4 + Den sporstof produceres i en cyklotron via protonbombardement af den ilt atom af vand (typisk resulterer i 100-200 mCi aktivitet til produktionsdyr oplysninger, se 12). Fordi mængden af 14 NH 3/14 NH4 + er ekstremt lavt i disse løsninger, N koncentrationen af stamopløsningen er ubetydelig.
4. Direkte Tilstrømning (DI) Måling
- For 42 K + afpipettér mængden af radioaktivt stamopløsning kræves for at nå den ønskede endelige koncentration af K + i mærkningsløsning.
- For 13 NH 3/13 NH4 +, pipette en lille mængde (<0,5 ml) i mærkningen løsning. Lad mærkning løsning til at blandes grundigt (via beluftning).
- Pipette en 1 ml delprøve mærkning opløsning i en prøve hætteglas og gentag tre gange (4 prøver i alt).
- Mål radioaktivitet i hætteglas (i "tællinger per minut", CPM) ved hjælp af en gammatæller. Sørg for, at tælleren er programmeret sådan, at cpm aflæsninger er korrigeret for isotopisk henfald (dette er særligt vigtigt, at sådanne kortlivede sporstoffer).
- Beregn S o (udtrykt som CPM pmol -1) ved at tage gennemsnittet af de tællinger af de fire prøver (CPM ml -1) og dividere med koncentrationen af substrat i opløsning (pmol ml -1).
- Fordyb rødder i præ-mærkning (ikke-radioaktivt) opløsning i 5 min, til at pre-ligevægt planter under prøvningsbetingelser (sef.eks 10,13,14 variationer i præ-label tid).
- Fordyb rødder i mærkning (radioaktiv) opløsning i 5 min.
BEMÆRK: Mærkningssymboler tider kan variere baseret på eksperiment 3,4,7-10. - Overførsel rødder til desorptionsopløsningen 5 sek for at fjerne størstedelen af overfladen vedhængende radioaktivitet. Overfør rødder i et andet bægerglas af desorptionsopløsningen i 5 minutter yderligere klare rødder ekstracellulære sporstof.
- Dissekere og separate skud, basale skud og rødder.
- Placer rødder i centrifugeglas og spin-prøver til 30 sek i en lav hastighed, at klinisk kvalitet centrifuge (~ 5.000 xg) fjerne overflade og interstitiel vand.
- Rødder (frisk vægt, FW) afvejes.
- Tæl radioaktivitet i plante prøver (skyde, basal Shoot, og rod, se trin 4.2.1).
- Beregn flux. Beregn indstrømning i anlægget ved hjælp af formlen
Φ = Q * / S o vægt L
hvor Φ er fluxen(Pmol g -1 time -1), Q * er mængden af sporstof akkumuleret i væv (cpm, som regel i rod, skyde, og basal skyde, kombineret), S o er den specifikke aktivitet af mærkningen opløsning (CPM pmol - 1), w er roden frisk vægt (g) og t L er mærkning tid (timer).
BEMÆRK: Mere sofistikeret beregning kan foretages for at tage højde for samtidig sporstof udstrømning fra rødder i løbet af mærkning og desorption baseret på parametre opnået fra CATE (se nedenfor for detaljer, se 4).
5. kompartmental Analyse af Tracer udstrømning (CATE) Måling
- Forbered mærkningsløsning og måle S o (se trin 4,1-4,2, ovenfor).
- Mål fortyndingsfaktor (D f).
BEMÆRK: Ofte kan positionen af prøven i forhold til detektoren i gammatæller påvirke mængdenstråling målt. Se diskussionen for detaljer.- Efter måling S o, tilsættes 19 ml H2O til hver prøve (således at slutvolumen = eluat volumen = 20 ml). Tæl radioaktivitet i hver 20 ml prøve (se trin 4.2.1).
- Beregn U f ved at dividere den gennemsnitlige cpm af 1 ml prøver af den gennemsnitlige cpm af de 20 ml prøver.
- Fordyb rødder i mærkningsløsning i 1 time.
- Fjern planter fra mærkningsløsning og overføre planter til at udstrømning tragt, der sikrer alle rodemateriale er inden tragten. Forsigtigt sikre anlæg til en side af efflux tragt ved at anvende en lille strimmel tape over plastik krave.
- Hæld forsigtigt det første eluat i tragten. Start timer (tælle op).
- Åbn studsen, og eluatet opsamles i hætteglasset prøve efter 15 sek (bemærk: eluering vil variere, se nedenfor). Luk studsen. Hæld forsigtigt den næste eluat i tragten.
- Repeat trin 5.6 for resten af elueringen serie, som følger, fra den første til den endelige eluat: 15 sek (fire gange), 20 sek (tre gange), 30 sek (to gange), 40 sek (en gang), 50 sek (en gang), 1 min (25 gange) til et samlet eluering periode på 29,5 min
BEMÆRK: Desorption serien kan variere baseret på eksperimentelle betingelser 7-10,13,14. - Når eluering protokol er færdig, høst planter (trin 4,6 - 4,8, ovenfor).
- Tæl radioaktivitet i eluater og plante prøver i gammatæller (multiplicere læsning for hver eluat af D f, se 5.2).
- Plot frigivelse af markør (cpm g (rod FW) -1 min -1) som en funktion af elueringstid. Til steady-state betingelser, udføre lineære regressioner og beregninger af flux, halveringstider på udveksling, og pool størrelser (for detaljer, se 6-9).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser isotermer fundet ved hjælp af DI teknik (med 13 N), for tilstrømningen af NH3 i rødder intakte bygkimplanter dyrket ved høj (10 mM) NH4 +, og enten lav (0,02 mM) eller høj (5 mM ) K +. Isotermerne viser Michaelis-Menten-kinetik, når NH 3 flusmidler er plottet som en funktion af ydre NH3-koncentration ([NH3] ext, justeret ved ændringer i pH 13). NH 3 flux var signifikant højere ved lave K + end ved høj K +. Analyse af Michaelis-Menten kinetiske parametre viste, at K M var forholdsvis stabil mellem K + niveauer (150 vs 90 μ M ved lav og høj K +,), mens V max er stærkt reduceret ved høj K + (205 vs 80 pmol g -1 time -1). Således data viser, at K +-niveau regulates kvælstof transport (V max effekt), men ikke ved direkte konkurrence mellem K + og NH 3 for bindingssteder i transportvirksomheder (K M effekt). Tværtimod kan K + regulere NH 3 flusmidler på andre måder, såsom gennem modulering af Aquaporin aktivitet (for detaljer, se 13).
DI er også nyttige til registrering af relativt hurtige ændringer i indstrømning på grund af ernæringsmæssige skift, eller anvendelsen af farmakologiske midler. For eksempel Figur 2 viser den hurtige plasticitet K + -uptake system rødder intakte bygkimplanter dyrket ved moderat (0,1 mM) -K + og høj (10 mM) -NH 4 + vilkår. Her observerede vi en ~ 350% stigning i K + tilstrømning inden for 5 minutter af NH4 + tilbagetrækning fra ekstern løsning. Denne "ammonium tilbagetrækning effekt" ("AWE") viste sig at være følsomme over for K + +), barium (Ba 2 +), og cæsium (Cs +). Brug DI og elektrofysiologiske målinger i flere Arabidopsis genotyper, var vi i stand til endegyldigt tilskrive det store flertal af AWE til ændringer i aktiviteterne i Arabidopsis K +-kanal, AtAKT1 og høj affinitet K + transportør, AtHAK5 14.
Figur 3 afbilder steady state efflux af 42 K +, over tid, fra rødder af pre-mærket bygkimplanter dyrket ved lav (0,1 mM) K + og moderat (1 mM) NO 3 -. Disse spor viser, hvordan CATE metode kan afsløre hurtige og væsentlige ændringer i udstrømning ved påføring af forskellige farmakologiske / ernæringsmæssige midler. Betydelig, øjeblikkelig hæmning af K + efflux blev observeret ved enten en anvendelse af 10 mM Cs +, en K + -kanal blocker, eller en kraftig stigningi K + bestemmelse (fra 0,1 til 10 mM). Disse resultater er i overensstemmelse med molekylære studier, der beskriver de unikke gating egenskaber af passiv afhjælpe K + kanaler 15. Derimod anvendelse af 10 mM NH4 + hurtigt og kraftigt stimuleret K + efflux. Denne virkning kan forklares ved aktivering af passiv ensrettende K +-kanaler via depolarisering af den elektriske spændingsgradient over plasmamembranen af rodcellerne 16, der vides at forekomme ved indføring af NH4 + 17. Således bruger denne metode, har vi været i stand til at påvise, i planta, at K + kanaler mægle K + efflux i rødderne af byg 10.
Endelig Tabel 1 viser CATE parametre udvundet fra målinger af steady-state 42 K + efflux ([K +] ext = 0,1 mM) i byg frølanger dyrket enten med 1 mM NO 3 - eller 10 mM NH4 +, hvor sidstnævnte repræsenterer en giftig scenarie. Den høje NH4 + tilstand medfører en undertrykkelse af alle K + flux, og et betydeligt fald i cytosol K +-koncentration ([K +] cyt), der normalt homeostatically holdes på ~ 100 mm under sunde vækstbetingelser 18 (som observeret , fx i tabel 1, under nr 3 - forsyning).
Figur 1. 13 NH 3 tilstrømning isotermer afsløre, hvordan K + forsyning regulerer kvælstof transport. NH3 tilstrømning som funktion af varierende eksterne koncentrationer af NH
Figur 2. NH4 stimulerer + tilbagetrækning betydeligt kanal-medierede K + tilstrømning. K + tilstrømning ved steady state, og efter tilbagetrækning af NH4 +, i rødderne af intakte bygkimplanter dyrket ved lav (0,1 mM) K + og høj (10 mM) NH4 +. Effekten af K + channel blockers (10 mM TEA +, 5 mM Ba 2 + og 10 mM Cs +) på stimulerede K + influx udtalt. En asterisk angiver forskellige niveauer af signifikans mellem -NH 4 + og behandling par (* 0,01 <P <0,05, *** p <0,001, en-vejs ANOVA med Dunnetts multipel sammenligning post-hoctest). Stjernerne i parentes angiver signifikansniveau mellem kontrol og -NH 4 + par (Students t-test). Error søjler angiver SEM af> 4 replikater. (Gengivet fra Coskun et al. Kapacitet og plasticitet kaliumkanaler og høj affinitet transportører i rødderne af byg og Arabidopsis. Plant Physiol. 162, 496-511 (2013).)
Figur 3. K + efflux er kanal-medieret under lav-K + betingelser Steady state 42 K + efflux i rødderne af intakte bygkimplanter dyrket ved lav (0,1 mM) K + og moderat (1 mM) NO 3 -., Og de umiddelbare virkninger (ved t = 15,5 min, se pilen) 10 mM CsCl 5 mM K 2 SO4 og 5 mM (NH4) 2 SO 4 på udstrømningen. Hvert plot repræsenterer middelværdien af 3-13 gentagelser (SEM <15% af middelværdien). (Gengivet fra Coskun m.fl. forordning og mekanisme for kalium frigivelse fra byg rødder:.. En i planta 42 K + analyse Ny Phytol 188, 1028-1038 (2010)..)
| [K +] ext | N kilde | Tilstrømning | Efflux | Net Flux | E: Jeg Ratio | Pool Størrelse | Halveringstiden |
| (MM) | (Pmol g -1 time -1) | (MM) | (Min) | ||||
| 0.1 | 1 NO 3 - | 7,22 ± 0,23 | 1,86 ± 0,18 | 5,36 ± 0,18 | 0,25 ± 0,02 | 98,84 ± 14,08 | 28,18 ± 3,40 |
| 10 NH4 + | 1,89 ± 0,13 | 0,57 ± 0,05 | 1,32 ± 0,10 | 0,30 ± 0,01 | 28,39 ± 3,40 | 32,50 ± 4,69 | |
Tabel 1. Steady state K + flusmidler og Compartmentation under forskellige N bestemmelser Steady state flux og kompartment analyse af bygkimplanter vokset med 0,1 mM K +, og enten moderat NO 3 -. (1 mM, som Ca2 + salt) eller høj NH4 + (10 mM, som SO 4 2-salt). Fejl angiver ± SEM af> 8 replikater. (Gengivet fra Coskun m.fl. forordning og mekanisme for kalium frigivelse fra byg rødder:.. En i planta 42 K + analyse Ny Phytol 188, 1028-1038 (2010) og Coskun m.fl. Kapacitet og plasticitet kaliumkanaler og høj.. affinity transportører i rødder af byg og Arabidopsis. Plant Physiol. 162, 496-511 (2013).)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som påvist i ovenstående eksempler, radiotraceren metoden er et effektivt middel til at måle ensrettede strømme af næringsstoffer og giftstoffer i planta. Figur 1 viser, at NH3 tilstrømning kan nå over 225 pmol g -1 time -1, som måske er den højeste bona fide transmembranfluxhastigheden nogensinde rapporteret i et plante-system 13, men omfanget af denne flux ville ikke være synlige, hvis der kun netto flusmidler blev målt. Dette er fordi en stor udstrømning NH3 finder sted på samme tid som tilstrømning i en nytteløs cykling scenario, som kan resultere i en markant undervurdering af tilstrømning som øger med mærkning tid 13. Ved at supplere sporstof teknik med elektrofysiologisk analyse, var vi i stand til at vise, at i henhold til betingelserne i figur 1, både tilstrømning og udstrømning af 13 N er primært af den neutrale gas NH 3, og ikke af dens conjugspiste syre NH4 + (for detaljer, se 13). Dette er den første i planta demonstration af hurtige NH3 gas flux i rødderne, og som sådan, giver vigtige foreløbige beviser mod optrevling transport mekanisme, der ligger i hjertet af NH 3 / NH 4 + toksicitet i højere planter 2,13. Molekylær arbejde i heterolog ekspression systemer har vist, at NH3 kan flyde gennem aquaporiner i planter 19, og data fra figur 1, sammen med nyere farmakologisk bevismateriale, er begyndt at underbygge disse resultater på niveau med den intakte organisme 13.
Figur 2 og 3 giver også fremragende eksempler på nytten af at måle ensrettede strømme med radioaktive sporstoffer. Brug DI med 42 K +, var vi i stand til at påvise, at ion-kanaler er ikke ansvarlig for steady state K + + og høj NH4 +, i modsætning til modelsystemet Arabidopsis 14. Kun når NH4 + blev trukket tilbage gjorde vi ser beviser for ansættelse af K + kanaler (figur 2). Selv nettostrømmen K + også stimuleres af NH4 + tilbagetrækning (som vist ved forøget væv K + indhold 14), kun ved at måle ensrettet indstrømning var vi i stand til at afsløre størrelsen og hurtig indtræden af dette fænomen. Desuden, ved at udføre DI målinger med mutanter og farmakologiske midler, var vi i stand til at identificere hvilke transport-proteiner var involveret. Ligeledes ved at anvende ernæringsmæssige og farmakologiske midler under overvågning sporstof udstrømning (figur 3), var vi i stand til at karakterisere og identificere mekanismer K + efflux fra byg rodcellerne 10. Således teknikker såsom DIog CATE kan være medvirkende til forståelsen af transport egenskaber for en kritisk makronæringsstoffer.
Som bemærket i protokollen, ofte positionen af prøven i forhold til detektoren i gammatæller kan påvirke mængden af stråling målt. Så hvis en 1 ml prøve "toppet op" med 19 ml H2O, kan tællingerne målte (cpm) i 20 ml prøve være betydeligt lavere end i 1-ml prøve, på trods af at have den samme mængde af radiotracer. Derfor kan en D f, anvendes til at korrigere for denne tilsyneladende fortynding "af radioaktivitet. Dette spørgsmål er ofte ikke udtrykkeligt af producenter af afsløring instrumentering og skal udarbejdes af den enkelte forsker. Tilsvarende kan effektiviteten af afskærmning inden detektorer mod omgivende stråling (dvs. fra nærliggende prøver i tælleren) være overdrevet af fabrikanterne, og sådanne spørgsmål bør udarbejdesud for individuelle målesystemer.
En stor fordel af sporstoffet teknikken er dets ikke-invasiv, hvilket giver et middel til at måle flux, intracellulære pool størrelser og valutakurser, under steady-state betingelser. For eksempel med CATE, kunne vi ikke-invasivt kvantificere cytosoliske koncentrationer af K + (tabel 1). Dette kan være at foretrække at alternative fremgangsmåder, såsom impalement af celler med ionselektive mikroelektroder 18, som giver fysiske og eventuelt kemiske forstyrrelser cellen. Desuden sporstoffet teknikken er enestående, fordi det giver et samlet overblik over flusmidler og opdelingen for hele organer og intakte anlæg. Dette er vigtigt, hvis man er interesseret i at forstå hele-plante næringsstofdynamik, toksicitet, og i sidste ende, ydeevne i marken. Endelig radiotracer metoder giver mulighed for meget følsomme målinger skal udføres i henhold til forholdsvis høje substratkoncentrationer. Tradinale udtynding eksperimenter og mikroelektrode teknikker kan opleve problemer med baggrund indblanding og derfor kan kræve, at den eksterne koncentration af substrat af interesse sænkes godt hvad der er fastsat under væksten. Dette kan være problematisk, hvis man er interesseret i at studere "steady-state" betingelser for høje substratkoncentrationer (såsom med NH3 / NH4 + toksicitet eller "høj-K +" betingelser, se ovenfor).
Det skal bemærkes, at ligesom alle teknikker, måling fluxe med radioaktive sporstoffer er ikke uden sine begrænsninger. For eksempel kan tilgængeligheden af radioaktive sporstoffer være problematisk, især for meget kortlivede isotoper som 13 N, der kræver tæt på et produktionsanlæg, såsom en cyklotron. En anden væsentlig begrænsning er, at til tider kan det være svært at skelne mellem flusmidler, der finder sted på tværs af membraner og dem, der forekommer extracellularly. En sådan skelnen kræver streng fase teste 7,10,20. I tilfælde af K + efflux, efter en omhyggelig undersøgelse var vi i stand til at bekræfte, at steady state 42 K + frigivelse fra rødderne foregik ikke på tværs af cellemembraner ved høj [K +] ext (> 1 mM) 10, men fra ekstracellulære mellemrum (CF, figur 3). Sådanne spørgsmål kan løses ved at undersøge effekten af en lang række farmakologiske midler eller gennem termodynamiske analyser, som har for eksempel vist, at meget høje Na + flux indberettet i henhold saltvandsforhold ville være energisk urealistisk blev de til at fortsætte over cellemembraner 21,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Model: Wallac 1480 Wizard 3" | |
| Geiger-Müller counter | Ludlum Measurements Inc. | Model 3 survey meter | |
| 400 ml glass beakers | VWR | 89000-206 | For pre-absorption, absorption, and desorption solutions |
| Glass funnel | VWR | 89000-466 | For efflux funnel |
| Large tubing | VWR | 529297 | For efflux funnel |
| Medium tubing | VWR | 684783 | For bundling |
| Small tubing | VWR | 63013-541 | For aeration |
| Aeration manifold | Penn Plax Air Tech | vat 5.5 | To control/distribute pressurized air into solutions |
| Glass scintillation vials | VWR | 66022-128 | For gamma counting |
| Glass centrifuge tubes | VWR | 47729-576 | For spin-drying root samples |
| Kimwipes | VWR | 470173-504 | For spin-drying root samples |
| Dissecting scissors | VWR | 470001-828 | |
| Forceps | VWR | 470005-496 | |
| Low-speed clinical centrifuge | International Equipment Co. | 76466M-4 | For spin-drying root samples |
| 1 ml pipette | Gilson | F144493 | |
| 10 ml pipette | Gilson | F144494 | |
| 1 ml pipette tips | VWR | 89079-470 | |
| 10 ml pipette tips | VWR | 89087-532 | |
| Analytical balance | Mettler toledo | PB403-S/FACT |
References
- Kronzucker, H. J., Coskun, D., Schulze, L. M., Wong, J. R., Britto, D. T. Sodium as nutrient and toxicant. Plant Soil. 369, 1-23 (2013).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. NH4+ toxicity in higher plants: a critical review. J. Plant Physiol. 159, 567-584 (2002).
- Epstein, E. Mechanism of ion absorption by roots. Nature. 171, 83-84 (1953).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Can unidirectional influx be measured in higher plants? A mathematical approach using parameters from efflux analysis. New Phytol. 150, 37-47 (2001).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Cellular mechanisms of potassium transport in plants. Physiol. Plant. 133, 637-650 (2008).
- Walker, N. A., Pitman, M. G. Measurement of fluxes across membranes. Encyclopedia of plant physiology. Lüttge, U., >Pitman, M. .G. 2 Part A, Springer. Berlin. (1976).
- Kronzucker, H. J., Siddiqi, M. Y., Glass, A. D. M. Analysis of 13NH4+ efflux in spruce roots - A test case for phase identification in compartmental analysis. Plant Physiol. 109, 481-490 (1995).
- Siddiqi, M. Y., Glass, A. D. M., Ruth, T. J. Studies of the uptake of nitrate in barley. 3. Compartmentation of NO3-. J. Exp. Bot. 42, 1455-1463 (1991).
- Lee, R. B., Clarkson, D. T. Nitrogen-13 studies of nitrate fluxes in barley roots. 1. Compartmental analysis from measurements of 13N efflux. J. Exp. Bot. 37, 1753-1767 (1986).
- Coskun, D., Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Regulation and mechanism of potassium release from barley roots: an in planta 42K+ analysis. New Phytol. 188, 1028-1038 (2010).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Fluxes measurements of cations using radioactive tracers. Plant Mineral Nutrients: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Maathuis, F. .J. .M. ., Volume 953, Springer. 161-170 (2013).
- Meeks, J. C. 13N techniques. Nitrogen isotope techniques. Knowles, R. ,, Blackburn, T. .H. , Academic Press. 273-303 (1993).
- Coskun, D., Britto, D. T., Li, M., Becker, A., Kronzucker, H. J. Rapid ammonia gas transport accounts for futile transmembrane cycling under NH3/NH4+ toxicity in plant roots. Plant Physiol. 163, 1859-1867 (2013).
- Coskun, D., Britto, D. T., Li, M., Oh, S., Kronzucker, H. J. Capacity and plasticity of potassium channels and high-affinity transporters in roots of barley and Arabidopsis. Plant Physiol. 162, 496-511 (2013).
- Johansson, I., et al. External K+ modulates the activity of the Arabidopsis potassium channel SKOR via an unusual mechanism. Plant J. 46, 269-281 (2006).
- Nocito, F. F., Sacchi, G. A., Cocucci, M. Membrane depolarization induces K+ efflux from subapical maize root segments. New Phytol. 154, 45-51 (2002).
- Wang, M. Y., Glass, A. D. M., Shaff, J. E., Kochian, L. V. Ammonium uptake by rice roots. 3. Electrophysiology. Plant Physiol. 104, 899-906 (1994).
- Walker, D. J., Leigh, R. A., Miller, A. J. Potassium homeostasis in vacuolate plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 10510-10514 (1996).
- Holm, L. M., et al. NH3 and NH4+ permeability in aquaporin-expressing Xenopus oocytes. Pflugers Archiv. Eur. J. Physiol. 450, 415-428 (2005).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Trans-stimulation of 13NH4+ efflux provides evidence for the cytosolic origin of tracer in the compartmental analysis of barley roots. Funct. Plant Biol. 30, 1233-1238 (2003).
- Malagoli, P., Britto, D. T., Schulze, L. M., Kronzucker, H. J. Futile Na+ cycling at the root plasma membrane in rice (Oryza sativa L.): kinetics, energetics, and relationship to salinity tolerance. J. Exp. Bot. 59, 4109-4117 (2008).
- Kronzucker, H. J., Britto, D. T. Sodium transport in plants: a critical review. New Phytol. 189, 54-81 (2011).
