قياس تدفقاتها من المغذيات المعدنية والمواد السامة في النباتات مع المشعة الراسمات
Summary
In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K+) and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.
Abstract
Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K+) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.
Introduction
امتصاص وتوزيع المواد الغذائية والمواد السامة تؤثر بقوة نمو النبات. وفقا لذلك، والتحقيق في عمليات النقل الأساسية يشكل أحد المجالات الرئيسية للبحوث في بيولوجيا النبات والعلوم الزراعية 1،2، خاصة في سياقات تحسين التغذية والضغوط البيئية (مثل الإجهاد الملحي والسمية الأمونيوم). ومن أهم الطرق لقياس التدفقات في النباتات هو استخدام استشفاف نظائر مشعة، والذي تم تطويره بشكل كبير في 1950s (انظر على سبيل المثال، 3) ولا يزال يستخدم على نطاق واسع اليوم. أساليب أخرى، مثل قياس نضوب المغذيات من الجذر المتوسطة و / أو تراكم في الأنسجة، واستخدام الميكروية تهتز ايون انتقائية مثل MIFE (مسرى مكروي أيون تقدير التدفق) وSIET (مسح ايون انتقائية تقنية القطب)، واستخدام ايون انتقائية الأصباغ الفلورية، كما تطبق على نطاق واسع، ولكن محدودة في قدرتها على اكتشاف انفلونزا صافيXES (أي الفرق بين تدفق وهروب رأس المال). استخدام النظائر المشعة، من ناحية أخرى، يسمح للباحث قدرة فريدة على عزل وقياس تدفقات أحادي الاتجاه، والتي يمكن استخدامها لحل المعلمات الحركية (على سبيل المثال، K M و V كحد أقصى)، وتوفير نظرة ثاقبة وقدرة، علم الطاقة، الآليات، والتنظيم، ونظم النقل. قياسات تدفق أحادي الاتجاه المصنوع من بالدلائل المشعة هي مفيدة بشكل خاص في ظل ظروف حيث تدفق في الاتجاه المعاكس عالية، ودوران حمامات داخل الخلايا سريع 4. وعلاوة على ذلك، أساليب المشع تسمح قياسات لإجراء تحت تركيزات الركيزة عالية نسبيا، على عكس العديد من التقنيات الأخرى (انظر "مناقشة"، أدناه)، وذلك لأن لاحظ النظائر تتبع على خلفية نظير آخر من نفس العنصر.
هنا، ونحن نقدم خطوات تفصيلية لقياس بالنظائر المشعة من أحادي الاتجاه و nآخرون تدفقات المغذيات المعدنية والمواد السامة في النباتات سليمة. سوف يتم التركيز على قياس تدفق البوتاسيوم (K +)، والمغذيات الكبيرة المصنع 5، والأمونيا / الأمونيوم (NH 3 / NH 4 +)، المغذيات الكبيرة آخر الذي هو، ومع ذلك، سامة عندما تكون موجودة بتركيزات عالية (على سبيل المثال، 1- 10 ملي) 2. سوف نستخدم النظائر المشعة 42 K + (ر 1/2 = 12.36 ساعة) و 13 NH 3/13 NH 4 + (ر = 9.98 1/2 دقيقة)، على التوالي، في شتلات سليمة من الشعير النظام النموذجي (شعير فولغاري L .)، في وصف بروتوكولين الرئيسية: تدفق مباشر (DI) والتحليل المجزئ من هروب رأس المال التتبع (CATE). ينبغي أن نلاحظ منذ البداية أن هذه المادة تصف ببساطة الخطوات اللازمة لتنفيذ كل بروتوكول. ، وتقدم عند الاقتضاء شروح موجزة من العمليات الحسابية والنظرية، ولكن مفصلة المعارض من كل تقنيةخلفية الصورة والنظرية يمكن العثور عليها في العديد من المواد الأساسية في موضوع 4،6-9. الأهم من ذلك، هذه البروتوكولات قابلة للتحويل على نطاق واسع لتحليل تدفق المواد المغذية الأخرى / المواد السامة (مثل 24 غ + 22 غ + 86 + الروبيديوم، 13 NO 3 -) والأنواع النباتية الأخرى، ولكن مع بعض المحاذير (انظر أدناه) . كما نؤكد على أهمية أن جميع الباحثين العاملين مع المواد المشعة يجب أن تعمل بموجب ترخيص ترتيبها من خلال تنظيم السلامة من الإشعاع المؤين المؤسسات الخاصة بهم.
Protocol
Representative Results
Discussion
كما هو موضح في الأمثلة أعلاه، وطريقة المشع هو وسيلة قوية لقياس تدفقات أحادي الاتجاه من المواد الغذائية والمواد السامة في بلانتا الشكل 1 يبين أن NH 3 تدفق يمكن أن تصل إلى ما يزيد على 225 ميكرومول ز -1 ساعة -1، التي ربما تكون أعلى حسن تدفق …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC), the Canada Research Chair (CRC) program, and the Canadian Foundation for Innovation (CFI).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Model: Wallac 1480 Wizard 3" | |
| Geiger-Müller counter | Ludlum Measurements Inc. | Model 3 survey meter | |
| 400-mL glass beakers | VWR | 89000-206 | For pre-absorption, absorption, and desorption solutions |
| Glass funnel | VWR | 89000-466 | For efflux funnel |
| Large tubing | VWR | 529297 | For efflux funnel |
| Medium tubing | VWR | 684783 | For bundling |
| Small tubing | VWR | 63013-541 | For aeration |
| Aeration manifold | Penn Plax Air Tech | vat 5.5 | To control/distribute pressurized air into solutions |
| Glass scintillation vials | VWR | 66022-128 | For gamma counting |
| Glass centrifuge tubes | VWR | 47729-576 | For spin-drying root samples |
| Kimwipes | VWR | 470173-504 | For spin-drying root samples |
| Dissecting scissors | VWR | 470001-828 | |
| Forceps | VWR | 470005-496 | |
| Low-speed clinical centrifuge | International Equipment Co. | 76466M-4 | For spin-drying root samples |
| 1-mL pipette | Gilson | F144493 | |
| 10-mL pipette | Gilson | F144494 | |
| 1-mL pipette tips | VWR | 89079-470 | |
| 10-mL pipette tips | VWR | 89087-532 | |
| Analytical balance | Mettler toledo | PB403-S/FACT |
Riferimenti
- Kronzucker, H. J., Coskun, D., Schulze, L. M., Wong, J. R., Britto, D. T. Sodium as nutrient and toxicant. Plant Soil. 369, 1-23 (2013).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. NH4+ toxicity in higher plants: a critical review. J. Plant Physiol. 159, 567-584 (2002).
- Epstein, E. Mechanism of ion absorption by roots. Nature. 171, 83-84 (1953).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Can unidirectional influx be measured in higher plants? A mathematical approach using parameters from efflux analysis. New Phytol. 150, 37-47 (2001).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Cellular mechanisms of potassium transport in plants. Physiol. Plant. 133, 637-650 (2008).
- Walker, N. A., Pitman, M. G., Lüttge, U., >Pitman, M. .. G. Measurement of fluxes across membranes. Encyclopedia of plant physiology. 2 Part A, (1976).
- Kronzucker, H. J., Siddiqi, M. Y., Glass, A. D. M. Analysis of 13NH4+ efflux in spruce roots – A test case for phase identification in compartmental analysis. Plant Physiol. 109, 481-490 (1995).
- Siddiqi, M. Y., Glass, A. D. M., Ruth, T. J. Studies of the uptake of nitrate in barley. 3. Compartmentation of NO3-. J. Exp. Bot. 42, 1455-1463 (1991).
- Lee, R. B., Clarkson, D. T. Nitrogen-13 studies of nitrate fluxes in barley roots. 1. Compartmental analysis from measurements of 13N efflux. J. Exp. Bot. 37, 1753-1767 (1986).
- Coskun, D., Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Regulation and mechanism of potassium release from barley roots: an in planta 42K+ analysis. New Phytol. 188, 1028-1038 (2010).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J., Maathuis, F. .. J. .. M. .. ,. Fluxes measurements of cations using radioactive tracers. Plant Mineral Nutrients: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Volume 953, 161-170 (2013).
- Meeks, J. C., Knowles, R. ,., Blackburn, T. .. H. 13N techniques. Nitrogen isotope techniques. , 273-303 (1993).
- Coskun, D., Britto, D. T., Li, M., Becker, A., Kronzucker, H. J. Rapid ammonia gas transport accounts for futile transmembrane cycling under NH3/NH4+ toxicity in plant roots. Plant Physiol. 163, 1859-1867 (2013).
- Coskun, D., Britto, D. T., Li, M., Oh, S., Kronzucker, H. J. Capacity and plasticity of potassium channels and high-affinity transporters in roots of barley and Arabidopsis. Plant Physiol. 162, 496-511 (2013).
- Johansson, I., et al. External K+ modulates the activity of the Arabidopsis potassium channel SKOR via an unusual mechanism. Plant J. 46, 269-281 (2006).
- Nocito, F. F., Sacchi, G. A., Cocucci, M. Membrane depolarization induces K+ efflux from subapical maize root segments. New Phytol. 154, 45-51 (2002).
- Wang, M. Y., Glass, A. D. M., Shaff, J. E., Kochian, L. V. Ammonium uptake by rice roots. 3. Electrophysiology. Plant Physiol. 104, 899-906 (1994).
- Walker, D. J., Leigh, R. A., Miller, A. J. Potassium homeostasis in vacuolate plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 10510-10514 (1996).
- Holm, L. M., et al. NH3 and NH4+ permeability in aquaporin-expressing Xenopus oocytes. Pflugers Archiv. Eur. J. Physiol. 450, 415-428 (2005).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Trans-stimulation of 13NH4+ efflux provides evidence for the cytosolic origin of tracer in the compartmental analysis of barley roots. Funct. Plant Biol. 30, 1233-1238 (2003).
- Malagoli, P., Britto, D. T., Schulze, L. M., Kronzucker, H. J. Futile Na+ cycling at the root plasma membrane in rice (Oryza sativa L.): kinetics, energetics, and relationship to salinity tolerance. J. Exp. Bot. 59, 4109-4117 (2008).
- Kronzucker, H. J., Britto, D. T. Sodium transport in plants: a critical review. New Phytol. 189, 54-81 (2011).
