Medindo Fluxos de nutrientes minerais e substâncias tóxicas em plantas com Traçadores Radioativos
Summary
In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K+) and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.
Abstract
Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K+) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.
Introduction
A absorção e distribuição dos nutrientes e toxinas influenciar fortemente o crescimento da planta. Assim, a investigação de processos de transporte subjacentes constitui uma importante área de pesquisa em biologia de plantas e ciências agrárias 1,2, especialmente nos contextos de otimização nutricional e estresse ambiental (por exemplo, estresse salino, a toxicidade de amônio). O chefe entre os métodos para a medição de fluxos em plantas é o uso de traçadores radioisótopos, que foi desenvolvido de forma significativa na década de 1950 (ver, por exemplo, 3) e continua a ser amplamente utilizado hoje. Outros métodos, como a medição de esgotamento dos nutrientes do meio de raiz e / ou acumulação nos tecidos, o uso de microeletrodos vibrando íon-seletivo, tais como Mife (microeletrodos ion estimativa de fluxo) e SIET (varredura técnica do eletrodo íon-seletivo), e uso de corantes fluorescentes íon-seletivo, também são amplamente aplicadas, mas são limitados em sua capacidade de detectar gripe netxes (isto é, a diferença entre o influxo e de efluxo). A utilização de radioisótopos, por outro lado, permite que o investigador a capacidade única para isolar e quantificação dos fluxos unidireccionais, que pode ser usada para resolver os parâmetros cinéticos (por exemplo, K M e V max), e fornecer informações sobre a capacidade, energética, mecanismos e regulação, dos sistemas de transporte. Medições de fluxos unidirecionais feitos com radiofármacos são particularmente úteis em condições onde o fluxo na direção oposta é alta, eo volume de negócios de pools intracelulares é rápida 4. Além disso, métodos de radiofármaco permite que as medições sejam realizadas sob concentrações bastante elevadas de substrato, ao contrário de muitas outras técnicas (ver "Discussão", abaixo), porque o isótopo traçado observa-se contra um fundo de outro isótopo do mesmo elemento.
Aqui, nós fornecemos instruções detalhadas para a medição de radioisótopos unidirecional e net fluxos de nutrientes minerais e substâncias tóxicas em plantas intactas. A ênfase será feita na medição de fluxo de potássio (K +), um macronutriente planta 5, e de amoníaco / amónio (NH 3 / NH 4 +), que é um outro macronutriente, no entanto, tóxicos quando presente em concentrações elevadas (por exemplo, 1 10 mM) 2. Vamos usar os radioisótopos 42 K + (t = 12,36 meia hr) e 13 NH 3/13 NH 4 + (t 1/2 = 9,98 min), respectivamente, em plântulas intactas do sistema modelo de cevada (Hordeum vulgare L .), na descrição de dois protocolos principais: influxo directa (DI) e análise compartimental por efluxo do marcador (CATE). Devemos notar desde o início que este artigo simplesmente descreve as etapas necessárias para realizar cada protocolo. Sempre que necessário, breves explicações sobre cálculos e teoria são fornecidos, mas detalhadas exposições de cada técnica'S de fundo e teoria pode ser encontrada em vários artigos importantes sobre o assunto 4,6-9. É importante ressaltar que estes protocolos são amplamente transferíveis ao fluxo análise de outros nutrientes / tóxicos (por exemplo, 24 de Na +, Na + 22, 86 Rb +, 13 NO 3 -) e outras espécies de plantas, embora com algumas ressalvas (veja abaixo) . Ressaltamos também a importância de que todos os pesquisadores que trabalham com materiais radioativos devem trabalhar sob uma licença organizadas através ionizante regulador de segurança de radiação de sua instituição.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tal como demonstrado nos exemplos acima, o método de traçador é um meio poderoso para medir fluxos unidireccionais de nutrientes e de agentes tóxicos in planta. Figura 1 mostra que o influxo de NH3 pode chegar a mais de 225 g mol -1 hora -1, o que é, talvez, o maior bona fide fluxo transmembrana já registrado em um sistema de planta 13, mas a magnitude deste fluxo não seria visível se apenas fluxos líquidos foram medidos. Isto aconte…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC), the Canada Research Chair (CRC) program, and the Canadian Foundation for Innovation (CFI).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Model: Wallac 1480 Wizard 3" | |
| Geiger-Müller counter | Ludlum Measurements Inc. | Model 3 survey meter | |
| 400-mL glass beakers | VWR | 89000-206 | For pre-absorption, absorption, and desorption solutions |
| Glass funnel | VWR | 89000-466 | For efflux funnel |
| Large tubing | VWR | 529297 | For efflux funnel |
| Medium tubing | VWR | 684783 | For bundling |
| Small tubing | VWR | 63013-541 | For aeration |
| Aeration manifold | Penn Plax Air Tech | vat 5.5 | To control/distribute pressurized air into solutions |
| Glass scintillation vials | VWR | 66022-128 | For gamma counting |
| Glass centrifuge tubes | VWR | 47729-576 | For spin-drying root samples |
| Kimwipes | VWR | 470173-504 | For spin-drying root samples |
| Dissecting scissors | VWR | 470001-828 | |
| Forceps | VWR | 470005-496 | |
| Low-speed clinical centrifuge | International Equipment Co. | 76466M-4 | For spin-drying root samples |
| 1-mL pipette | Gilson | F144493 | |
| 10-mL pipette | Gilson | F144494 | |
| 1-mL pipette tips | VWR | 89079-470 | |
| 10-mL pipette tips | VWR | 89087-532 | |
| Analytical balance | Mettler toledo | PB403-S/FACT |
Riferimenti
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