מדידת שטפים של חומרים מזינים ומינרליים רעלים בצמחים עם חומרים רדיואקטיביים
Summary
In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K+) and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.
Abstract
Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K+) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.
Introduction
הספיגה וההפצה של חומרים מזינים ורעלים משפיעים במידה רבה גידול צמחים. בהתאם לכך, חקירתם של תהליכי העברה הבסיסיים מהווה אזור מרכזי של מחקר בביולוגיה צמח ומדעי חקלאות 1,2, במיוחד בהקשרים של אופטימיזציה התזונתית ולחצים סביבתיים (למשל, מתח מלח, רעילות אמוניום). ראשי בין שיטות למדידה והנתיבים בצמחים הוא השימוש בקליעים נותבים radioisotopic, אשר פותחו באופן משמעותי ב1950s (ראה, למשל, 3) וממשיך להיות בשימוש נרחב כיום. שיטות אחרות, כגון מדידה של דלדול מזין ממדיום השורש ו / או ההצטברות ברקמות, שימוש בmicroelectrodes רוטט יון סלקטיבי כגון MIFE (microelectrode יון הערכת שטף) וSIET (טכניקת אלקטרודה יון סלקטיבי סריקה), ושימוש של צבעי ניאון יון סלקטיבי, גם מיושמים באופן נרחב, אך הם מוגבלים ביכולתם לזהות שפעת נקיXES (כלומר, ההבדל בין הזרם וזרימה). השימוש ברדיואיזוטופים, לעומת זאת, מאפשר לחוקר את היכולת הייחודית לבודד ולכמת והנתיבים חד כיווני, אשר יכול לשמש לפתרון פרמטרים הקינטית (למשל, K M ומקסימום V), ולספק תובנות הקיבולת, האנרגטיקה, מנגנונים, ורגולציה, מערכות תחבורה. מדידות שטף חד כיווני שנעשו עם radiotracers הן שימושיות במיוחד בתנאים בהם השטף בכיוון ההפוך הוא גבוה, והמחזור של בריכות תאיות הוא 4 מהירים. יתר על כן, שיטות radiotracer לאפשר מדידות להתנהל תחת ריכוזי מצע גבוהים למדי, בניגוד לרבי טכניקות אחרות (ראה 'דיון', להלן), כי איזוטופ לייחס הוא ציין על רקע איזוטופ אחר של אותו היסוד.
כאן, אנו מספקים שלבים מפורטים למדידת radioisotopic של חד כיווני וnנתיבי et של חומרים מזינים מינרלים ורעלים בצמחים שלמים. דגש יינתן על מדידת שטף של אשלגן (K +), הוא חומר מזין מפעל 5, ואמוניה / אמוניום (NH 3/4 NH +), חומר מזין אחר שהיא, לעומת זאת, רעילה כאשר קיימת בריכוזים גבוהים (למשל, 1 10 מ"מ) 2. אנו נשתמש ברדיואיזוטופים 42 K + (t 1/2 = 12.36 hr) ו13 NH 3/13 4 + (t 1/2 = 9.98 דקות), בהתאמה, בשתילים שלמים של השעורה מערכת מודל (L vulgare Hordeum NH .), בתיאור של שני פרוטוקולים עיקריים: זרם ישיר (DI) וניתוח compartmental על ידי זרימה נותב (קייט). אנחנו צריכים לשים לב מלכתחילה שמאמר זה פשוט מתאר את הצעדים דרושים כדי לבצע כל פרוטוקול. תערוכות שבו מתאים, הסברים קצרים על חישובים והתאוריה מסופקים, אבל מפורטת של כל טכניקהניתן למצוא רקע והתאוריה של 'בכמה מאמרי מפתח בנושא 4,6-9. חשוב לציין, פרוטוקולים אלה באופן רחב להעברה לשטף ניתוח של חומרים מזינים / רעלים אחרים (למשל, 24 Na +, 22 Na +, 86 Rb +, 13 NO 3 -) ולמיני צמחים אחרים, אם כי עם כמה אזהרות (ראה להלן) . גם אנו מדגישים את החשיבות שכל חוקרי עובדים עם חומרים רדיואקטיביים חייבים לעבוד תחת רישיון מסודר דרך רגולטור בטיחות קרינה מייננת של המוסד שלהם.
Protocol
Representative Results
Discussion
כפי שמודגם בדוגמאות לעיל, שיטת radiotracer היא אמצעי רב עוצמה למדידה והנתיבים חד כיווני של חומרים מזינים ורעלים בPlanta. איור 1 מראה כי NH 3 זרם יכול להגיע מעבר לשעתי 225 μmol -1 גרם -1, שהוא אולי השטף הטרנסממברני תום הלב הגבוה ביותר שדווח אי פעם ב?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC), the Canada Research Chair (CRC) program, and the Canadian Foundation for Innovation (CFI).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Model: Wallac 1480 Wizard 3" | |
| Geiger-Müller counter | Ludlum Measurements Inc. | Model 3 survey meter | |
| 400-mL glass beakers | VWR | 89000-206 | For pre-absorption, absorption, and desorption solutions |
| Glass funnel | VWR | 89000-466 | For efflux funnel |
| Large tubing | VWR | 529297 | For efflux funnel |
| Medium tubing | VWR | 684783 | For bundling |
| Small tubing | VWR | 63013-541 | For aeration |
| Aeration manifold | Penn Plax Air Tech | vat 5.5 | To control/distribute pressurized air into solutions |
| Glass scintillation vials | VWR | 66022-128 | For gamma counting |
| Glass centrifuge tubes | VWR | 47729-576 | For spin-drying root samples |
| Kimwipes | VWR | 470173-504 | For spin-drying root samples |
| Dissecting scissors | VWR | 470001-828 | |
| Forceps | VWR | 470005-496 | |
| Low-speed clinical centrifuge | International Equipment Co. | 76466M-4 | For spin-drying root samples |
| 1-mL pipette | Gilson | F144493 | |
| 10-mL pipette | Gilson | F144494 | |
| 1-mL pipette tips | VWR | 89079-470 | |
| 10-mL pipette tips | VWR | 89087-532 | |
| Analytical balance | Mettler toledo | PB403-S/FACT |
Riferimenti
- Kronzucker, H. J., Coskun, D., Schulze, L. M., Wong, J. R., Britto, D. T. Sodium as nutrient and toxicant. Plant Soil. 369, 1-23 (2013).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. NH4+ toxicity in higher plants: a critical review. J. Plant Physiol. 159, 567-584 (2002).
- Epstein, E. Mechanism of ion absorption by roots. Nature. 171, 83-84 (1953).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Can unidirectional influx be measured in higher plants? A mathematical approach using parameters from efflux analysis. New Phytol. 150, 37-47 (2001).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Cellular mechanisms of potassium transport in plants. Physiol. Plant. 133, 637-650 (2008).
- Walker, N. A., Pitman, M. G., Lüttge, U., >Pitman, M. .. G. Measurement of fluxes across membranes. Encyclopedia of plant physiology. 2 Part A, (1976).
- Kronzucker, H. J., Siddiqi, M. Y., Glass, A. D. M. Analysis of 13NH4+ efflux in spruce roots – A test case for phase identification in compartmental analysis. Plant Physiol. 109, 481-490 (1995).
- Siddiqi, M. Y., Glass, A. D. M., Ruth, T. J. Studies of the uptake of nitrate in barley. 3. Compartmentation of NO3-. J. Exp. Bot. 42, 1455-1463 (1991).
- Lee, R. B., Clarkson, D. T. Nitrogen-13 studies of nitrate fluxes in barley roots. 1. Compartmental analysis from measurements of 13N efflux. J. Exp. Bot. 37, 1753-1767 (1986).
- Coskun, D., Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Regulation and mechanism of potassium release from barley roots: an in planta 42K+ analysis. New Phytol. 188, 1028-1038 (2010).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J., Maathuis, F. .. J. .. M. .. ,. Fluxes measurements of cations using radioactive tracers. Plant Mineral Nutrients: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Volume 953, 161-170 (2013).
- Meeks, J. C., Knowles, R. ,., Blackburn, T. .. H. 13N techniques. Nitrogen isotope techniques. , 273-303 (1993).
- Coskun, D., Britto, D. T., Li, M., Becker, A., Kronzucker, H. J. Rapid ammonia gas transport accounts for futile transmembrane cycling under NH3/NH4+ toxicity in plant roots. Plant Physiol. 163, 1859-1867 (2013).
- Coskun, D., Britto, D. T., Li, M., Oh, S., Kronzucker, H. J. Capacity and plasticity of potassium channels and high-affinity transporters in roots of barley and Arabidopsis. Plant Physiol. 162, 496-511 (2013).
- Johansson, I., et al. External K+ modulates the activity of the Arabidopsis potassium channel SKOR via an unusual mechanism. Plant J. 46, 269-281 (2006).
- Nocito, F. F., Sacchi, G. A., Cocucci, M. Membrane depolarization induces K+ efflux from subapical maize root segments. New Phytol. 154, 45-51 (2002).
- Wang, M. Y., Glass, A. D. M., Shaff, J. E., Kochian, L. V. Ammonium uptake by rice roots. 3. Electrophysiology. Plant Physiol. 104, 899-906 (1994).
- Walker, D. J., Leigh, R. A., Miller, A. J. Potassium homeostasis in vacuolate plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 10510-10514 (1996).
- Holm, L. M., et al. NH3 and NH4+ permeability in aquaporin-expressing Xenopus oocytes. Pflugers Archiv. Eur. J. Physiol. 450, 415-428 (2005).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Trans-stimulation of 13NH4+ efflux provides evidence for the cytosolic origin of tracer in the compartmental analysis of barley roots. Funct. Plant Biol. 30, 1233-1238 (2003).
- Malagoli, P., Britto, D. T., Schulze, L. M., Kronzucker, H. J. Futile Na+ cycling at the root plasma membrane in rice (Oryza sativa L.): kinetics, energetics, and relationship to salinity tolerance. J. Exp. Bot. 59, 4109-4117 (2008).
- Kronzucker, H. J., Britto, D. T. Sodium transport in plants: a critical review. New Phytol. 189, 54-81 (2011).
