Mess Flüsse von Mineralstoffen und Giftstoffe in Pflanzen, die mit radioaktiver Tracer
Summary
In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K+) and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.
Abstract
Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K+) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.
Introduction
Die Aufnahme und Verteilung von Nährstoffen und Schadstoffen stark beeinflussen das Pflanzenwachstum. Dementsprechend ist die Untersuchung der zugrunde liegenden Transportprozesse stellt einen wichtigen Bereich der Forschung in der Pflanzenbiologie und Agrarwissenschaften 1,2, vor allem in den Kontexten der Ernährungsoptimierung und Umweltbelastungen (zB Salzstress, Ammoniumtoxizität). Das wichtigste Verfahren zur Messung von Flussmitteln in Pflanzen ist die Verwendung von Radioisotopen-Tracer, die sich in den 1950er Jahren entwickelt wurde (siehe Beispiel 3) und ist bis heute weit verbreitet. Andere Verfahren, wie die Messung von Nährstoffverarmung aus dem Wurzelmedium und / oder Akkumulation in Geweben, die Verwendung von Ionen-selektiven Mikroschwing wie Mife (Mikro Ionenfluß Schätzung) und SIET (Rasterionenselektive Elektrode Technik), und die Verwendung von Ionen-selektiven Fluoreszenzfarbstoffe, werden ebenfalls häufig verwendet, sind aber in ihrer Fähigkeit, Netz Grippe erkennen begrenztxes (dh die Differenz zwischen Zufluss und Abfluss). Die Verwendung von Radioisotopen, auf der anderen Seite ermöglicht es dem Forscher die einzigartige Fähigkeit, zu isolieren und zu quantifizieren unidirektionalen Flüsse, die verwendet werden können, um die kinetischen Parameter zu lösen (zB K M und V max) und geben einen Einblick in die Fähigkeit, Energetik, Mechanismen und die Regulation von Transportsystemen. Gleichfluss-Messungen mit Radiotracer sind besonders unter Bedingungen, wo der Fluss in die entgegengesetzte Richtung ist hoch nützlich, und der Umsatz von intrazellulären Pools ist schnell 4. Außerdem ermöglichen Radiotracer Methoden Messungen unter relativ hohen Substratkonzentrationen im Gegensatz zu vielen anderen Verfahren durchgeführt werden (siehe "Discussion", unten), weil die zurück Isotop vor dem Hintergrund der anderen Isotop des gleichen Elements beobachtet.
Hier bieten wir detaillierte Schritte für die Radioisotopenmessung von unidirektionalen und net Flüsse von Mineralstoffen und Giftstoffen in intakten Pflanzen. Der Schwerpunkt wird auf die Flussmessung von Kalium (K +), einer Pflanze macronutrient 5 und Ammonium / Ammoniak hergestellt werden (NH 3 / NH 4 +), ein anderes Makronährstoffe, die, wenn sie bei hohen Konzentrationen (beispielsweise vorhanden ist, jedoch giftig, 1- 10 mM) 2. Wir werden die Radioisotope 42 K + (t 1/2 = 12,36 h) und 13 NH 13.03 NH 4 + (t 1/2 = 9,98 min), jeweils in intakten Keimlingen der Modellsystem Gerste (Hordeum vulgare L verwenden .), in der Beschreibung der beiden wichtigsten Protokolle: direkte Zustrom (DI) und Kompartment-Analyse durch Tracer-Efflux (CATE). Wir sollten von Anfang an, die in diesem Artikel beschrieben einfach die erforderlich sind, um jedes Protokoll führen Sie die Schritte beachten. Gegebenenfalls werden kurze Erklärungen zu den Berechnungen und Theorie zur Verfügung gestellt, aber detaillierte Darstellungen der einzelnen Verfahren'S Hintergrund und Theorie kann in mehreren wichtigen Artikel über das Thema 4,6-9 gefunden werden. Wichtig ist, dass diese Protokolle allgemein übertragbar Analyse anderer Nährstoffe / Giftstoffe Strom (zB 24 Na +, Na + 22, 86 Rb +, 13 NO 3 -) und anderen Pflanzenspezies, wenn auch mit einigen Einschränkungen (siehe unten) . Wir betonen auch die Bedeutung, dass alle Forscher, die mit radioaktiven Stoffen muss unter einer Lizenz durch ionisierende Strahlung Sicherheitsregler ihrer Institution angeordnet zu arbeiten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wie in den obigen Beispielen gezeigt, ist der Radiotracer-Methode ein mächtiges Mittel zur Messung der unidirektionalen Flüsse der Nährstoffe und Giftstoffe in der Pflanze. Abbildung 1 zeigt, dass NH 3 Zustrom in über 225 mmol g -1 h -1, das ist vielleicht das ist zu erreichen höchste bona fide Transmembranfluss je in einem Anlagensystem 13 berichtet, aber das Ausmaß dieser Fluss nicht sichtbar sein, wenn nur die Nettoflüsse gemessen w…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC), the Canada Research Chair (CRC) program, and the Canadian Foundation for Innovation (CFI).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Model: Wallac 1480 Wizard 3" | |
| Geiger-Müller counter | Ludlum Measurements Inc. | Model 3 survey meter | |
| 400-mL glass beakers | VWR | 89000-206 | For pre-absorption, absorption, and desorption solutions |
| Glass funnel | VWR | 89000-466 | For efflux funnel |
| Large tubing | VWR | 529297 | For efflux funnel |
| Medium tubing | VWR | 684783 | For bundling |
| Small tubing | VWR | 63013-541 | For aeration |
| Aeration manifold | Penn Plax Air Tech | vat 5.5 | To control/distribute pressurized air into solutions |
| Glass scintillation vials | VWR | 66022-128 | For gamma counting |
| Glass centrifuge tubes | VWR | 47729-576 | For spin-drying root samples |
| Kimwipes | VWR | 470173-504 | For spin-drying root samples |
| Dissecting scissors | VWR | 470001-828 | |
| Forceps | VWR | 470005-496 | |
| Low-speed clinical centrifuge | International Equipment Co. | 76466M-4 | For spin-drying root samples |
| 1-mL pipette | Gilson | F144493 | |
| 10-mL pipette | Gilson | F144494 | |
| 1-mL pipette tips | VWR | 89079-470 | |
| 10-mL pipette tips | VWR | 89087-532 | |
| Analytical balance | Mettler toledo | PB403-S/FACT |
Riferimenti
- Kronzucker, H. J., Coskun, D., Schulze, L. M., Wong, J. R., Britto, D. T. Sodium as nutrient and toxicant. Plant Soil. 369, 1-23 (2013).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. NH4+ toxicity in higher plants: a critical review. J. Plant Physiol. 159, 567-584 (2002).
- Epstein, E. Mechanism of ion absorption by roots. Nature. 171, 83-84 (1953).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Can unidirectional influx be measured in higher plants? A mathematical approach using parameters from efflux analysis. New Phytol. 150, 37-47 (2001).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Cellular mechanisms of potassium transport in plants. Physiol. Plant. 133, 637-650 (2008).
- Walker, N. A., Pitman, M. G., Lüttge, U., >Pitman, M. .. G. Measurement of fluxes across membranes. Encyclopedia of plant physiology. 2 Part A, (1976).
- Kronzucker, H. J., Siddiqi, M. Y., Glass, A. D. M. Analysis of 13NH4+ efflux in spruce roots – A test case for phase identification in compartmental analysis. Plant Physiol. 109, 481-490 (1995).
- Siddiqi, M. Y., Glass, A. D. M., Ruth, T. J. Studies of the uptake of nitrate in barley. 3. Compartmentation of NO3-. J. Exp. Bot. 42, 1455-1463 (1991).
- Lee, R. B., Clarkson, D. T. Nitrogen-13 studies of nitrate fluxes in barley roots. 1. Compartmental analysis from measurements of 13N efflux. J. Exp. Bot. 37, 1753-1767 (1986).
- Coskun, D., Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Regulation and mechanism of potassium release from barley roots: an in planta 42K+ analysis. New Phytol. 188, 1028-1038 (2010).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J., Maathuis, F. .. J. .. M. .. ,. Fluxes measurements of cations using radioactive tracers. Plant Mineral Nutrients: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Volume 953, 161-170 (2013).
- Meeks, J. C., Knowles, R. ,., Blackburn, T. .. H. 13N techniques. Nitrogen isotope techniques. , 273-303 (1993).
- Coskun, D., Britto, D. T., Li, M., Becker, A., Kronzucker, H. J. Rapid ammonia gas transport accounts for futile transmembrane cycling under NH3/NH4+ toxicity in plant roots. Plant Physiol. 163, 1859-1867 (2013).
- Coskun, D., Britto, D. T., Li, M., Oh, S., Kronzucker, H. J. Capacity and plasticity of potassium channels and high-affinity transporters in roots of barley and Arabidopsis. Plant Physiol. 162, 496-511 (2013).
- Johansson, I., et al. External K+ modulates the activity of the Arabidopsis potassium channel SKOR via an unusual mechanism. Plant J. 46, 269-281 (2006).
- Nocito, F. F., Sacchi, G. A., Cocucci, M. Membrane depolarization induces K+ efflux from subapical maize root segments. New Phytol. 154, 45-51 (2002).
- Wang, M. Y., Glass, A. D. M., Shaff, J. E., Kochian, L. V. Ammonium uptake by rice roots. 3. Electrophysiology. Plant Physiol. 104, 899-906 (1994).
- Walker, D. J., Leigh, R. A., Miller, A. J. Potassium homeostasis in vacuolate plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 10510-10514 (1996).
- Holm, L. M., et al. NH3 and NH4+ permeability in aquaporin-expressing Xenopus oocytes. Pflugers Archiv. Eur. J. Physiol. 450, 415-428 (2005).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Trans-stimulation of 13NH4+ efflux provides evidence for the cytosolic origin of tracer in the compartmental analysis of barley roots. Funct. Plant Biol. 30, 1233-1238 (2003).
- Malagoli, P., Britto, D. T., Schulze, L. M., Kronzucker, H. J. Futile Na+ cycling at the root plasma membrane in rice (Oryza sativa L.): kinetics, energetics, and relationship to salinity tolerance. J. Exp. Bot. 59, 4109-4117 (2008).
- Kronzucker, H. J., Britto, D. T. Sodium transport in plants: a critical review. New Phytol. 189, 54-81 (2011).
