Het meten van stromen van minerale nutriënten en toxische stoffen in planten met radioactieve tracers
Summary
In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K+) and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.
Abstract
Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K+) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.
Introduction
De opname en verdeling van nutriënten en toxische stoffen sterk beïnvloeden de groei van planten. Dienovereenkomstig, het onderzoek van de onderliggende transport processen vormt een belangrijk onderzoeksgebied in plantaardige biologie en landbouwwetenschappen 1,2, in het bijzonder in de context van de voedings-optimalisatie en milieu-invloeden (bijvoorbeeld zout stress, toxiciteit ammonium). De belangrijkste van werkwijzen voor het meten van stromen in planten is het gebruik van radio-isotopische tracers, ontwikkeld significant in 1950 (zie voorbeeld 3) en blijft nu algemeen gebruikt. Andere methoden, zoals meten tekort aan nutriënten van de wortel medium en / of accumulatie in weefsels, gebruik van ion-selectieve trillende micro-elektroden zoals MIFE (micro-elektrode ion flux schatting) en siet (scannen ion-selectieve electrode techniek), en het gebruik van ion-selectieve fluorescente kleurstoffen, ook algemeen worden toegepast, maar zijn beperkt in hun vermogen om netto griep detecterenxes (dwz het verschil tussen instroom en uitstroom). Het gebruik van radio-isotopen, anderzijds, kan de onderzoeker het unieke vermogen om te isoleren en te kwantificeren unidirectionele stromen, die kan worden gebruikt om de kinetische parameters te lossen (bijvoorbeeld K M en V max) en inzicht in de capaciteit energetica mechanismen en regelgeving, van transportsystemen. Unidirectionele flux metingen met radioliganden bijzonder bruikbaar onder omstandigheden waarbij de flux in de tegengestelde richting is hoog, en de omzet van intracellulaire zwembaden is snel 4. Bovendien radiotracer methoden toe te voeren metingen onder vrij hoge concentraties substraat, in tegenstelling tot vele andere technieken (zie "Discussion", hieronder), omdat het overgetrokken isotoop is waargenomen tegen een achtergrond van een ander isotoop van hetzelfde element.
Hier bieden we gedetailleerde stappen voor het radio-isotoop meting van unidirectionele en net stromen van minerale nutriënten en toxische stoffen in intacte planten. Nadruk worden aangegaan flux meting van kalium (K +), een plant macronutriënt 5 en ammonia / ammonium (NH3 / NH4 +), andere macronutriënten die echter toxisch wanneer aanwezig bij hoge concentraties (bijvoorbeeld 1- 10 mM) 2. We zullen radioisotopen 42 K + (t 1/2 = 12,36 uur) en 13 NH 3/13 NH 4 + (t 1/2 = 9,98 min) respectievelijk in intacte zaailingen van het modelsysteem gerst (Hordeum vulgare L gebruiken .), in de beschrijving van twee belangrijke protocollen: directe instroom (DI) en compartimentale analyse door tracer efflux (CATE). We moeten er rekening mee vanaf het begin dat dit artikel gewoon de stappen die nodig zijn om elk protocol voeren beschrijft. In voorkomend geval, zijn korte beschrijvingen van de berekeningen en theorie aangeboden, maar gedetailleerde uiteenzettingen van elke techniek'S achtergrond en theorie is te vinden in een aantal belangrijke artikelen over het onderwerp 4,6-9. Belangrijk, deze protocollen zijn algemeen overdraagbaar analyse van andere voedingsstoffen / vergiften flux (bijvoorbeeld 24 Na +, Na + 22, 86 Rb +, 13 NO 3 -) en andere plantensoorten, zij het met enkele restricties (zie hieronder) . We benadrukken ook het belang dat alle onderzoekers die werken met radioactieve materialen moeten werken onder een licentie geregeld via ioniserende straling veiligheid regulator van hun instelling.
Protocol
Representative Results
Discussion
As demonstrated in the examples above, the radiotracer method is a powerful means of measuring unidirectional fluxes of nutrients and toxicants in planta. Figure 1 shows that NH3 influx can reach in excess of 225 µmol g-1 hr-1, which is perhaps the highest bona fide transmembrane flux ever reported in a plant system13, but the magnitude of this flux would not be visible if only net fluxes were measured. This is because a large efflux of N…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC), the Canada Research Chair (CRC) program, and the Canadian Foundation for Innovation (CFI).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Model: Wallac 1480 Wizard 3" | |
| Geiger-Müller counter | Ludlum Measurements Inc. | Model 3 survey meter | |
| 400-mL glass beakers | VWR | 89000-206 | For pre-absorption, absorption, and desorption solutions |
| Glass funnel | VWR | 89000-466 | For efflux funnel |
| Large tubing | VWR | 529297 | For efflux funnel |
| Medium tubing | VWR | 684783 | For bundling |
| Small tubing | VWR | 63013-541 | For aeration |
| Aeration manifold | Penn Plax Air Tech | vat 5.5 | To control/distribute pressurized air into solutions |
| Glass scintillation vials | VWR | 66022-128 | For gamma counting |
| Glass centrifuge tubes | VWR | 47729-576 | For spin-drying root samples |
| Kimwipes | VWR | 470173-504 | For spin-drying root samples |
| Dissecting scissors | VWR | 470001-828 | |
| Forceps | VWR | 470005-496 | |
| Low-speed clinical centrifuge | International Equipment Co. | 76466M-4 | For spin-drying root samples |
| 1-mL pipette | Gilson | F144493 | |
| 10-mL pipette | Gilson | F144494 | |
| 1-mL pipette tips | VWR | 89079-470 | |
| 10-mL pipette tips | VWR | 89087-532 | |
| Analytical balance | Mettler toledo | PB403-S/FACT |
Riferimenti
- Kronzucker, H. J., Coskun, D., Schulze, L. M., Wong, J. R., Britto, D. T. Sodium as nutrient and toxicant. Plant Soil. 369, 1-23 (2013).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. NH4+ toxicity in higher plants: a critical review. J. Plant Physiol. 159, 567-584 (2002).
- Epstein, E. Mechanism of ion absorption by roots. Nature. 171, 83-84 (1953).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Can unidirectional influx be measured in higher plants? A mathematical approach using parameters from efflux analysis. New Phytol. 150, 37-47 (2001).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Cellular mechanisms of potassium transport in plants. Physiol. Plant. 133, 637-650 (2008).
- Walker, N. A., Pitman, M. G., Lüttge, U., >Pitman, M. .. G. Measurement of fluxes across membranes. Encyclopedia of plant physiology. 2 Part A, (1976).
- Kronzucker, H. J., Siddiqi, M. Y., Glass, A. D. M. Analysis of 13NH4+ efflux in spruce roots – A test case for phase identification in compartmental analysis. Plant Physiol. 109, 481-490 (1995).
- Siddiqi, M. Y., Glass, A. D. M., Ruth, T. J. Studies of the uptake of nitrate in barley. 3. Compartmentation of NO3-. J. Exp. Bot. 42, 1455-1463 (1991).
- Lee, R. B., Clarkson, D. T. Nitrogen-13 studies of nitrate fluxes in barley roots. 1. Compartmental analysis from measurements of 13N efflux. J. Exp. Bot. 37, 1753-1767 (1986).
- Coskun, D., Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Regulation and mechanism of potassium release from barley roots: an in planta 42K+ analysis. New Phytol. 188, 1028-1038 (2010).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J., Maathuis, F. .. J. .. M. .. ,. Fluxes measurements of cations using radioactive tracers. Plant Mineral Nutrients: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Volume 953, 161-170 (2013).
- Meeks, J. C., Knowles, R. ,., Blackburn, T. .. H. 13N techniques. Nitrogen isotope techniques. , 273-303 (1993).
- Coskun, D., Britto, D. T., Li, M., Becker, A., Kronzucker, H. J. Rapid ammonia gas transport accounts for futile transmembrane cycling under NH3/NH4+ toxicity in plant roots. Plant Physiol. 163, 1859-1867 (2013).
- Coskun, D., Britto, D. T., Li, M., Oh, S., Kronzucker, H. J. Capacity and plasticity of potassium channels and high-affinity transporters in roots of barley and Arabidopsis. Plant Physiol. 162, 496-511 (2013).
- Johansson, I., et al. External K+ modulates the activity of the Arabidopsis potassium channel SKOR via an unusual mechanism. Plant J. 46, 269-281 (2006).
- Nocito, F. F., Sacchi, G. A., Cocucci, M. Membrane depolarization induces K+ efflux from subapical maize root segments. New Phytol. 154, 45-51 (2002).
- Wang, M. Y., Glass, A. D. M., Shaff, J. E., Kochian, L. V. Ammonium uptake by rice roots. 3. Electrophysiology. Plant Physiol. 104, 899-906 (1994).
- Walker, D. J., Leigh, R. A., Miller, A. J. Potassium homeostasis in vacuolate plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 10510-10514 (1996).
- Holm, L. M., et al. NH3 and NH4+ permeability in aquaporin-expressing Xenopus oocytes. Pflugers Archiv. Eur. J. Physiol. 450, 415-428 (2005).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Trans-stimulation of 13NH4+ efflux provides evidence for the cytosolic origin of tracer in the compartmental analysis of barley roots. Funct. Plant Biol. 30, 1233-1238 (2003).
- Malagoli, P., Britto, D. T., Schulze, L. M., Kronzucker, H. J. Futile Na+ cycling at the root plasma membrane in rice (Oryza sativa L.): kinetics, energetics, and relationship to salinity tolerance. J. Exp. Bot. 59, 4109-4117 (2008).
- Kronzucker, H. J., Britto, D. T. Sodium transport in plants: a critical review. New Phytol. 189, 54-81 (2011).
