마우스 태아 간 문화 시스템은 터미널 적혈구의 초기와 후기 단계에서 대상 유전자의 기능을 해부하기
Summary
우리는 터미널 적혈구의 초기와 후기 단계를 해부 체외 마우스 태아 간 erythroblast 문화 시스템을 제시한다. 이 시스템은 서로 다른 개발 단계에서 특정 유전자의 기능 분석을 용이하게한다.
Abstract
적혈구가 빠르게 형성 단위 적혈구 식민지 (CFU-ES)를 나누어 다음에 최선을 다하고 적혈구 버스트 형성 단위 (BFU-ES)로 시작하는 역동적 인 과정을 포함한다. CFU-ES 후, 세포는 형태 학적으로 인식 할 수 있으며 일반적으로 터미널 적혈구 모세포라고합니다. 단말기 적혈구의 연구 과제 중 하나는 연대순 방식 유전자 기능을 해부 실험 방법의 부족이다. 이 프로토콜에서는 단말 적혈구 생성의 초기와 후기 단계에서 유전자의 기능을 결정하기 위해 고유의 전략을 설명한다. 이 시스템에서 마우스 태아 간 TER119 (성숙한 적혈구 세포 마커) 부정적인 적혈구 모세포는 정제하고 cDNA를하거나 관심있는 유전자의 작은 머리 핀의 자형의 RNA (shRNA를)의 외생 적 표현 형질 도입. 세포를이어서 cDNA를 외인성 또는 shRNA를 허용하면서 12 시간 동안 그들의 전구 스테이지를 유지하는 에리트로 포이 에틴 (EPO) 이외의 다른 매체를 포함하는 성장 인자에서 배양 하였다표현. 세포는 외인성 유전 물질이 이미 발현 동안 세포 분화 및 증식을 유도하기 위하여 12 시간 후에 EPO 배지로 변경 하였다. 이 프로토콜은 단말 적혈구 생성의 초기 단계에서 유전자의 기능 분석을 용이하게한다. 후기 단말 적혈구 생성을 연구하기 위해, 세포를 형질 도입 후 즉시 EPO 배지에서 배양 하였다. 형질의 유전 물질이 발현 될 때 이러한 방법으로, 세포는 이미 단말기 적혈구의 말기로 분화되었다. 우리는 터미널 적혈구의 다른 단계에서 세부적인 유전자 기능을 이해하는 데 도움이 될 것이다이 전략의 일반적인 응용 프로그램을 권장합니다.
Introduction
적혈구는 적혈구 성숙 다 능성 조혈 줄기 세포의 분화 과정이다. 이 단계적인 과정은 최선을 다하고 적혈구 버스트 형성 단위 (BFU-ES), 빠른 속도로 나누어 적혈구 콜로니 형성 단위 (CFU-ES) 및 형태 학적 인식 적혈구 모세포 1,2의 형성을 포함한다. CFU-E의 전구 세포에서 터미널 적혈구는 순차적 에리트로 포이 에틴에 의존하고 독립적 인 단계 2,3을 포함한다. 단말기 적혈구 생성의 초기 단계에서, 에리트로 포이 에틴 (EPO)가 세포 표면 수용체에 결합하고 세포 사멸을 방지하고 빠른 세포 분열 및 유전자 발현을 촉진 1,4 하류 신호 전달 경로의 시리즈를 유도한다. 터미널 적혈구의 후반 단계에서 적혈구 모세포는 매우 응축 핵 5 단자 세포주기의 종료, 크로 마틴과 핵 응축, 압출을받을.
터미널 우리의 이해적혈구가 크게 때문에 체외에서 여러 가지의 성공적인 사용에 생체 마우스 모델 6-9에서 크게이다 지난 수십 년에 향상되었습니다. 이러한 모델 중 마우스 태아 간 적혈구 모세포의 체외 배양 세포 정화, 빠른 증식과 분화의 용이성 등 많은 장점을 제공하며, 인간의 적혈구 10, 11에 가까운 모방. 이 시스템에서, 마우스 태아 간에서 적혈구 전구 세포 다수 용이 TER119의 단일 단계 정제 (성숙한 적혈구 세포에 대한 마커) 네거티브 적혈구 모세포에 의해 단리 될 수있다. 적혈구 모세포의 이틀 동안 배양이 세포의 분화가 트랜스페린 수용체 (CD71) 및 TER119 항원 (12)의 표면 발현에 기초하여 유세포 분석으로 모니터 할 수있다. 또한, 말기 분화 적혈구 모세포 적출술 1 DNA 머신 (훽스트 33342)에 의해 검출 될 수있다3. 또한, 정제 된 전구 세포는 유전자의 cDNA 또는 적혈구 11,13,14에 유전자 발현 기능 역학적 연구를 용이 관심 유전자에 대한 작은 헤어핀 RNA들 (shRNA를)의 외인성 발현에 의해 변형 될 수있다.
그것이 단말 적혈구 생성의 다른 단계에서 유전자의 기능을 특성화하는 것이 곤란하기 때문에, 다른 한편으로는, 고속 셀 성장률 양면성 수있다. 대부분의 경우에, 그것의 cDNA 또는 shRNA를 발현 시간까지 보낸 단말 적혈구 생성의 초기 단계에서 특정 유전자의 기능, 세포가 이미 초기 단계를 통과했는지 여부를 결정하는 것은 곤란하다. 이 문제를 해결하기 위해서, 우리는 터미널 적혈구 생성의 초기와 후기 단계를 해부하는 독특한 시스템을 개발 하였다. 단말기 적혈구 생성의 초기 단계를 들면, 유전자 변형 TER119 네거티브 적혈구 모세포는 EPO 배지 함유하지만 줄기 세포 인자 (SCF)에서 IL-6 및 FLT3 배양리간드는 그들의 선조 상태를 유지하고, 식 (13)로 형질 도입 된 cDNA 또는 shRNA를 허용한다. 세포는 세포 증식 및 분화를 유도하기 위하여 12 시간 후에 EPO 함유 배지로 변경 하였다. 세포를 구별하기 시작할 때 이러한 방법으로, 형질 도입 된 cDNA 또는 shRNA를 이미 발현되었다. 터미널 적혈구의 후기를 들어, TER119 부정적인 적혈구 모세포는 EPO가 전달 후 즉시 매체를 포함에서 배양 하였다. 따라서, 하나의 단말은 적혈구 생성의 후반 단계에서의 관심의 유전자의 기능을 분석 할 수있다. 요약하면, 이러한 시스템의 광범위한 애플리케이션 단말 적혈구 생성의 다른 단계에서의 해부 유전자 기능을 도울 것이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 우리는 시간 순으로 마우스 태아 간 터미널 적혈구를 분석 할 수있는 독특한 시스템을 제시한다. 다른 배양 조건의 적용을 통해, 우리는 성공적으로 초기와 후기 단계에서 터미널 적혈구 해부. 이는 다양한 기능을 가진 유전자의 메카니즘을 결정하는데 중요하다. 예를 들어, 라 세미 GTPases 단자 적혈구 생성의 다른 단계에서 중요한 역할을한다. 터미널 적혈구에 영향 세포 분화와 증식의…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 NIH R00HL102154 지원 및 P 지행 혈액 학자 수상의 미국 사회되었다.
Materials
| Iscove's Modified Dulbecco's MediumIMDM (IMDM) | Gibco | 12440-053 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GEMINI Bio-product | 700-102P | |
| b-mecaptoethanol | Sigma | M6250 | 0.1 M in IMDM, 4℃stock |
| Penicillin-Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | 100 X |
| L-Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | 200 mM |
| Stem cell factor (SCF) | STEMCELL TECH | 2630 | 100 ng/ul, -20℃ stock |
| Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L) | BD Biosciences | 14-8001-80 | |
| Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6) | GEMINI Bio-product | 300-327P | |
| fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | STEMCELL TECH | 9300 | 10% stock in IMDM |
| Insulin solution, human | Sigma | I9278 | 4℃ stock |
| holo-transferrin human | Sigma | T0665 | 50 mg/ml in Water -20℃ stock |
| Erythropoietin(Epo) | PROCRIT | NOC 59676-303-00 | 3,000 U/ml stock |
| Streptavidin particles Plus | BD Pharmingen | 557812 | |
| EasySep Magnet | STEMCELL TECH | 18000 | |
| Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 ml | FALCON | 352063 |
Riferimenti
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