Ratón Sistema Cultura Hígado Fetal de diseccionar las funciones de genes objetivo en las primeras y últimas etapas de la Terminal de la eritropoyesis
Summary
Presentamos un ratón sistema de cultivo in vitro fetal eritroblasto hígado que disecciona las etapas tempranas y tardías de la eritropoyesis terminal. Este sistema facilita el análisis funcional de genes específicos en diferentes etapas de desarrollo.
Abstract
La eritropoyesis implica un proceso dinámico que comienza con unidades de ráfaga eritroides comprometidos formación (BFU-Es), seguido de rápida división de colonias eritroides unidades (UFC-E). Después de CFU-E, las células son morfológicamente reconocibles y generalmente denominado eritroblastos terminales. Uno de los retos para el estudio de la eritropoyesis de terminal es la falta de enfoques experimentales para diseccionar las funciones de genes de manera cronológica. En este protocolo, se describe una estrategia única para determinar las funciones de genes en las etapas tempranas y tardías de la eritropoyesis terminal. En este sistema, el ratón TER119 hígado fetal (marcador de células eritroides maduro) eritroblastos negativos fueron purificados y transducidas con la expresión exógena de los ADNc o pequeños ARN de horquilla (shRNAs) para los genes de interés. Las células se cultivaron posteriormente en medio que contiene factores de crecimiento distintos de eritropoyetina (Epo) para mantener su etapa progenitor durante 12 horas al tiempo que permite los ADNc exógenos o shRNAsexpresar. Las células se cambiaron a medio Epo después de 12 horas para inducir la diferenciación celular y la proliferación, mientras que los materiales genéticos exógenos ya se expresaron. Este protocolo facilita el análisis de las funciones de genes en la etapa temprana de la eritropoyesis terminal. Para estudiar finales de la eritropoyesis terminal de etapa, las células se cultivaron inmediatamente en un medio de Epo después de la transducción. De esta manera, las células ya se diferenciaron a la etapa tardía de la eritropoyesis terminal cuando se expresaron los materiales genéticos transducidas. Se recomienda una aplicación general de esta estrategia que ayudaría a entender las funciones de genes detalladas en las diferentes etapas de la eritropoyesis terminal.
Introduction
La eritropoyesis es el proceso de diferenciación de células madre hematopoyéticas multipotentes a eritrocitos maduros. Este proceso por etapas incluye la formación de unidades de ráfaga eritroides comprometidos de formación (BFU-ES), las unidades que se dividen rápidamente eritroides formadoras de colonias (CFU-ES), y morfológicamente reconocibles eritroblastos 1,2. Eritropoyesis Terminal de células progenitoras CFU-E implica eritropoyetina dependiente secuencial etapas independientes y 2,3. En la etapa temprana de la eritropoyesis terminal, eritropoyetina (EPO) se une a su receptor en la superficie celular e induce una serie de vías de señalización corriente abajo que impiden la apoptosis celular y promueven divisiones celulares rápidas y expresión génica 1,4. En la etapa tardía de la eritropoyesis terminal, eritroblastos se someten a la salida del ciclo celular terminal, y la condensación de la cromatina núcleo, y la extrusión de los núcleos altamente condensados 5.
Nuestra comprensión de la terminaleritropoyesis ha mejorado mucho en las últimas décadas, que es en gran parte debido a la utilización con éxito de varios in vitro e in vivo en modelos de ratones de 6-9. Entre estos modelos, el cultivo in vitro de ratón fetal eritroblastos hígado proporciona muchas ventajas, incluyendo la facilidad de purificación celular, proliferación y diferenciación rápida, y un cerrador imitan a la eritropoyesis humana 10,11. En este sistema, un gran número de células progenitoras eritroides a partir de hígados fetales de ratón pueden ser fácilmente aislados por la purificación solo paso de TER119 (un marcador para las células eritroides maduras) eritroblastos negativos. Durante el cultivo de dos días de los eritroblastos, la diferenciación de estas células puede ser monitoreado por un análisis de citometría de flujo basado en la expresión de superficie de receptor de transferrina (CD71) y el antígeno de TER119 12. Además, la enucleación de los eritroblastos de diferenciación terminal puede ser detectada por un fabricante de ADN (Hoechst 33342) 13. Además, los progenitores purificados se pueden modificar genéticamente por la expresión exógena de ADNc o pequeños ARN de horquilla (shRNAs) para los genes de interés, lo que facilita los estudios mecanísticos de las funciones de la expresión génica en la eritropoyesis 11,13,14.
Por otra parte, la tasa de crecimiento celular rápido puede ser una espada de doble filo, ya que es difícil de caracterizar las funciones de genes en diferentes etapas de la eritropoyesis terminal. En la mayoría de los casos, es difícil determinar si un funciones de genes específicos en la etapa temprana de la eritropoyesis desde el terminal en el momento en el ADNc o shRNAs expresaron, las células ya han pasado la etapa temprana. Para solucionar este problema, hemos desarrollado un sistema único para diseccionar las etapas tempranas y tardías de la eritropoyesis terminal. Para la etapa temprana de la eritropoyesis terminal, modificados genéticamente Ter119 eritroblastos negativos fueron cultivadas en medio libre de Epo-pero que contiene el factor de células madre (SCF), IL-6 y FLT3ligando para mantener su estado progenitor y deje los ADNc transducidas o shRNA de expresión 13. Las células se cambiaron a medio que contiene Epo después de 12 horas para inducir la proliferación y diferenciación celular. De esta manera, cuando las células empezaron a diferenciar, los ADNc fueron transducidas o shRNAs ya expresados. Para la etapa tardía de la eritropoyesis terminal, Ter119 eritroblastos negativos Epo fueron cultivadas en medio que contiene inmediatamente después de la transducción. Por lo tanto, se puede analizar las funciones de los genes de interés en la etapa tardía de la eritropoyesis terminal. En resumen, una amplia aplicación de este sistema ayudaría a las funciones de genes Dissect en diferentes etapas de la eritropoyesis terminal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí presentamos un sistema único para analizar cronológicamente ratón fetal eritropoyesis terminal de hígado. A través de la aplicación de diferentes condiciones de cultivo, disecado éxito eritropoyesis terminal en fases tempranas y tardías. Esto es particularmente importante para determinar los mecanismos de genes con múltiples funciones. Por ejemplo, GTPasas Rac juegan papeles importantes en diferentes etapas de la eritropoyesis terminal. La inhibición de Rac GTPasas en la etapa temprana de la diferenciaci…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por el NIH R00HL102154, y la Sociedad Americana de Hematología premio académico a P Ji.
Materials
| Iscove's Modified Dulbecco's MediumIMDM (IMDM) | Gibco | 12440-053 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GEMINI Bio-product | 700-102P | |
| b-mecaptoethanol | Sigma | M6250 | 0.1 M in IMDM, 4℃stock |
| Penicillin-Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | 100 X |
| L-Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | 200 mM |
| Stem cell factor (SCF) | STEMCELL TECH | 2630 | 100 ng/ul, -20℃ stock |
| Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L) | BD Biosciences | 14-8001-80 | |
| Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6) | GEMINI Bio-product | 300-327P | |
| fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | STEMCELL TECH | 9300 | 10% stock in IMDM |
| Insulin solution, human | Sigma | I9278 | 4℃ stock |
| holo-transferrin human | Sigma | T0665 | 50 mg/ml in Water -20℃ stock |
| Erythropoietin(Epo) | PROCRIT | NOC 59676-303-00 | 3,000 U/ml stock |
| Streptavidin particles Plus | BD Pharmingen | 557812 | |
| EasySep Magnet | STEMCELL TECH | 18000 | |
| Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 ml | FALCON | 352063 |
Riferimenti
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