Высокое содержание изображений Пробирной для идентификации ботулинического нейротоксина ингибиторов
Summary
Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.
Abstract
Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic neurotransmitter release. Botulinum neurotoxin serotype A (BoNT/A) is a zinc metalloprotease that blocks exocytosis of neurotransmitter by cleaving the SNAP-25 component of the SNARE complex. Currently there are no licensed medicines to treat BoNT/A poisoning after internalization of the toxin by motor neurons. The development of effective therapeutic measures to counter BoNT/A intoxication has been limited, due in part to the lack of robust high-throughput assays for screening small molecule libraries. Here we describe a high content imaging (HCI) assay with utility for identification of BoNT/A inhibitors. Initial optimization efforts focused on improving the reproducibility of inter-plate results across multiple, independent experiments. Automation of immunostaining, image acquisition, and image analysis were found to increase assay consistency and minimize variability while enabling the multiparameter evaluation of experimental compounds in a murine motor neuron system.
Introduction
Бактерия Clostridium ботулинического производит нейротоксин ботулизма, один из самых мощных биологических токсинов, известных человеку 1. Есть 7 различных ботулинического токсина серотипа (ботулинического токсина / AG). BoNT / A-Галль вызвать паралич в нервно-мышечном соединении из-за SNARE комплекса протеолиза 2,3. SNARE протеолиз предотвращает нейромедиатора везикул-слияние мембран и, следовательно, блоки нейротрансмиттеров экзоцитоз 4. Конкретный целевой SNARE, зависит от конкретного BoNT серотипа, вовлеченной в процесс интоксикации. BoNT / и BoNT / E расщепляют SNAP-25, тогда как BoNT / C расщепляет обе SNAP-25 и синтаксина 5. Остальные серотипов расщепляют синаптобревин (также называется везикул, ассоциированных мембранный белок (VAMP). BoNT / была выбрана для разработки анализа, как он отвечает за высокой долей природного ботулизма и имеет самую длинную продолжительность действия 6. Развитие малого молекулы терапевтические против BoNT / A является одной из основных целей длянаша программа открытие и использовал традиционные методы целевые основе выявить активные ингибиторы сайт протеолитические 7, 8-10. Тем не менее, создание активных ингибиторов сайта с действием широкого спектра против нескольких серотипов и эффективности постэкспозиционного, вероятно, будет сложным.
Поэтому мы внедрили инновационную фенотипическую наркотиков подход обнаружения, которая использует BoNT SNAP-25 расщепление в качестве функциональной конечной точки для определения малых молекул, которые могут блокировать BoNT-опосредованной двигательных нейронов интоксикации. SNAP-25 необходим для высвобождения нейротрансмиттеров, как деградация SNAP-25 является предиктором паралича и летальности в естественных условиях. Например, на основе клеток скрининг может привести к обнаружению новых модуляторов клеточных факторов, ответственных за токсин инактивации или ингибирования токсина путей внутри клеток-мишеней. Важным фактором в развитии фенотипической анализа является выбор физиологически соответствующих биологических моделей. Wе и другие описали мышиных эмбриональных стволовых (ES) клеток, полученных моторные нейроны, которые воспроизводят иммунологическую характер первичных двигательных нейронов, в том числе выражения SNAP-25 11- 13. Важно, что эти сотовые системы весьма чувствительны к BoNT / A интоксикации и демонстрируют зависимое от дозы расщепление SNAP-25 в ответ на увеличение концентрации токсина 11,12. Дифференцированные моторные нейроны производятся также в количествах, достаточных для анализа, основанного высокая пропускная пластины и разрешенных дизайн массив клеточных анализов.
Фенотипический анализ является методом иммунофлюоресценции с использованием двух различных антител для количественного расщепление эндогенно выразил полноразмерной SNAP-25 во время BoNT / A интоксикации мыши двигательных нейронов культуры. Карбоксильную терминал BoNT / расщепление чувствительных (BACS) антитело, которое распознает только полную длину SNAP-25 позволяет оценить BoNT / A опосредованного протеолиза SNAP-25выражение в двигателе мыши нейронов 10. Принципиальная схема анализа HCI изображен на рисунке 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Высокая эффективность ботулинического нейротоксина и относительной легкости их милитаризации привело их отнесения к категориям А (самый высокий приоритет) biothreat агентов по Центров США по контролю и профилактике заболеваний. К сожалению, не существует FDA не утвердил терапевтические п?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding was provided by the Joint Science and Technology Office – Chemical Biological Defense (JSTO-CBD) Defense Threat Reduction Agency (DTRA) under sponsor project number CCAR# CB3675 and National Institutes of Health (1 R21 AI101387-01 and 5 U01AI082051-05).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Botulinum neurotoxin A | Metabiologics | NA | No catalog number |
| Microtitre plates | Greiner | 655946 | Poly-D-Lysine 96-well plates |
| BACs antibody | Lampire Biological | NA | |
| Microchem | National | 0255 | |
| Methanol | Thermo Scientific | A412-20 | |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050 | |
| PE JANUS MDT Mini Automated Workstation | Perkin Elmer | AJMDT01 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Triton X 100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| BIII tubulin antibody | R&D Systems | BAM1195 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379-1L | |
| Hoechst 33342dye | Invitrogen | 3570 | |
| Antimouse IgG | Invitrogen | A21236 | |
| Anti rabbit IgG | Invitrogen | A10042 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.4 | |
| Spotfire | Perkin Elmer | Ver 5.5 | |
| Clorox bleach | Fisher Scientific | 18-861-284 | |
| PlateStack |
Riferimenti
- Lamanna, C. The most poisonous poison. Science. 130, 763-772 (1959).
- Dover, N., Barash, J. R., Hill, K. K., Xie, G., Arnon, S. S. Molecular Characterization of a Novel Botulinum Neurotoxin Type H Gene. J. Infect. Dis. , (2013).
- Hakami, R. M., Ruthel, G., Stahl, A. M., Bavari, S. Gaining ground: assays for therapeutics against botulinum neurotoxin. Trends in microbiology. 18, 164-172 (2010).
- Yersin, A., et al. Interactions between synaptic vesicle fusion proteins explored by atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 8736-8741 (2003).
- Dong, M., Tepp, W. H., Johnson, E. A., Chapman, E. R. Using fluorescent sensors to detect botulinum neurotoxin activity in vitro and in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 14701-14706 (2004).
- Stahl, A. M., Adler, M., and, C. B. M., Gilfillan, L. Accelerating botulism therapeutic product development in the Department of Defense. Drug Development Research. 70, 303-326 (2009).
- Nuss, J. E., et al. Development of cell-based assays to measure botulinum neurotoxin serotype A activity using cleavage-sensitive antibodies. Journal of biomolecular screening. 15, 42-51 (2010).
- Opsenica, I., et al. A chemotype that inhibits three unrelated pathogenic targets: the botulinum neurotoxin serotype A light chain, P. falciparum malaria, and the Ebola filovirus. Journal of medicinal chemistry. 54, 1157-1169 (2011).
- Opsenica, I., et al. The synthesis of 2,5-bis(4-amidinophenyl)thiophene derivatives providing submicromolar-range inhibition of the botulinum neurotoxin serotype A metalloprotease. European journal of medicinal chemistry. 53, 374-379 (2012).
- Nuss, J. E., et al. Pharmacophore Refinement Guides the Rational Design of Nanomolar-Range Inhibitors of the Botulinum Neurotoxin Serotype A Metalloprotease. ACS medicinal chemistry letters. 1, 301-305 (2010).
- Kiris, E., et al. Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery. Stem cell research. 6, 195-205 (2011).
- Pellett, S., et al. Neuronal targeting, internalization, and biological activity of a recombinant atoxic derivative of botulinum neurotoxin A. Biochemical and biophysical research communications. 405, 673-677 (2011).
- McNutt, P., Celver, J., Hamilton, T., Mesngon, M. Embryonic stem cell-derived neurons are a novel, highly sensitive tissue culture platform for botulinum research. Biochemical and biophysical research communications. 405, 85-90 (2011).
- Fischer, A., et al. Bimodal modulation of the botulinum neurotoxin protein-conducting channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 1330-1335 (2009).
