Les méthodes de mesures de capacité cellulaires attaché à la souris surrénales chromaffines cellule

Summary

After exocytosis, fused plasma membrane is retrieved through a process known as endocytosis. This mechanism reforms new synaptic vesicles for the next round of release. Individual endocytic events are captured and analyzed through the use of the cell-attached capacitance recordings in mouse adrenal chromaffin cells.

Abstract

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion known as exocytosis that mediates synaptic transmission. Subsequent retrieval of synaptic vesicles is necessary to generate new neurotransmitter-filled vesicles in a process identified as endocytosis. During exocytosis, fusing vesicle membranes will result in an increase in surface area and subsequent endocytosis results in a decrease in the surface area. Here, our lab demonstrates a basic introduction to cell-attached capacitance recordings of single endocytic events in the mouse adrenal chromaffin cell. This type of electrical recording is useful for high-resolution recordings of exocytosis and endocytosis at the single vesicle level. While this technique can detect both vesicle exocytosis and endocytosis, the focus of our lab is vesicle endocytosis. Moreover, this technique allows us to analyze the kinetics of single endocytic events. Here the methods for mouse adrenal gland tissue dissection, chromaffin cell culture, basic cell-attached techniques, and subsequent examples of individual traces measuring singular endocytic event are described.

Introduction

La transmission synaptique est médiée par exocytose des vésicules synaptiques contenant neurotransmetteurs, et ces vésicules doit subir recyclage d'endocytose locale dans la terminaison nerveuse de maintenir la communication neuronale dans le long terme. Compte tenu du rôle essentiel de la transmission synaptique dans le cerveau, la compréhension de la machinerie moléculaire qui constitue le cycle de la vésicule synaptique est un fondement essentiel pour une meilleure compréhension dans la communication cellulaire dans son ensemble. Parmi les systèmes de modèles de cellule, la cellule chromaffine surrénale a fourni une partie de la vision la plus définitive dans le mécanisme moléculaire sous-jacent recyclage des vésicules synaptiques. Exocytose, la dernière étape de la libération de neurotransmetteurs, a été extrêmement étudié et examiné par l'utilisation de la cellule surrénale chromaffin ^1,2. En fait, la plupart des acteurs moléculaires qui orchestrent la formation, le ciblage, accueil, et la fusion des granules de sécrétion ont été identifiés grâce à l'application de divERSE techniques dans les cellules chromaffines ^1. En outre, en offrant la possibilité de permettre la résolution unique vésicule de la machinerie protéique impliqué dans l'exocytose, la cellule chromaffin reste un modèle puissant pour répondre aux questions de la fusion des vésicules ^3.

Mesures de capacité cellules ont d'abord été utilisés attaché à résoudre seul la fusion des vésicules pendant l'exocytose ^3. L'exocytose de vésicules aussi petites que ~ 60 nm de diamètre ont été démontrées pour être détectée par des mesures admission de la membrane cellulaire avec la technique du patch clamp en configuration cellule attachée de ^4-7. Entrée est définie comme une mesure de la facilité avec un circuit ou un dispositif permettront passage d'un courant; il est l'inverse de l'impédance. Ainsi, des mesures d'admission permettent de comprendre la capacité de la membrane. Ceci est accompli par l'incorporation de la membrane vésiculaire dans la membrane plasmique; cette incorporation révèle des changements dans la surfacezone ^8. Chaque vésicule fusion provoque une augmentation progressive de la capacité de la membrane ^9,10. De plus, cette mesure d'admission fournit la conductance de la membrane et la conductance des pores fusion lors d'une sortie ³ exocytose. Comme cette technique a fourni un outil unique à identifier cinétique simple vésicule pendant l'exocytose, notre laboratoire a récemment appliqué ce concept à détecter l'endocytose des vésicules de simples ^11,12.

Notre intérêt particulier est la clathrine endocytose (CME), qui a été considéré comme un élément fondamental de ménage dans de nombreuses cellules ¹³ et en tant que principale voie d'endocytose des vésicules synaptiques dans les terminaux neuronales ^14,15. CME est connu pour être biologiquement important, cependant, sa cinétique restent pas bien compris en raison de limitations techniques dans la surveillance des événements singuliers endocytose. Compte tenu des similitudes dans les mécanismes d'exocytose entre les cellules et les neurones ¹ chromaffines, il est plausible que les mécanismes de fission dans les cellules chromaffines peuvent probablement s'appliquer à endocytose des vésicules synaptiques dans les neurones. Les mesures de capacité cell-attached ont été utilisés pour surveiller les événements d'endocytose individuels et analyser la cinétique de fission, dont la plupart des méthodes sont incapables de résoudre. Dans les enregistrements cell-attached, une onde sinusoïdale à 20 kHz est superposée sur le potentiel de maintien et le courant de sortie est séparé en la conductance membranaire dans un canal et la membrane capacitance dans l'autre canal à partir d'une à deux phases amplificateur à verrouillage ^{16 18.} A partir des variations de la conductance de la membrane et de la capacité, on peut calculer la cinétique de la fission-pore, ce qui correspond vraisemblablement à la tubulure de membrane tubulaire qui relie la vésicule intériorisation de la membrane plasmique des vésicules avant pincement. Collectivement, cette technique nous donne l'occasion d'examiner les mécanismes de régulation de la vésicule fission pendant CME.

Protocol

NOTE: L'ensemble de la procédure a été menée conformément aux lignes directrices des Instituts nationaux de la santé, tel qu'approuvé par le soin et l'utilisation des animaux Comité de l'Université de l'Illinois à Chicago. 1. Solutions et milieux de culture préparatifs Gardez toutes les solutions à -20 ° C pendant jusqu'à six mois. Gardez les milieux de culture à 4 ° C pendant 3 mois. Préparer 100 ml de milieu de culture en mélan…

Representative Results

La viabilité cellulaire et la qualité de l'étanchéité de gigaohm sont critiques dans la détermination de la qualité des enregistrements de capacité cell-attached. Par conséquent, il est essentiel de se procurer une culture cellulaire et efficace avant les enregistrements électrophysiologiques, et les cellules viables typiques sont illustrés dans la Figure 1. Pratique et l'heure vous seront utiles dans la réalisation d'un joint de gigaohm de haute qualité. Si l'on peut voir c…

Discussion

Mesure de la capacité de cellules attachée nécessitent plusieurs étapes critiques afin d'obtenir avec succès des enregistrements de haute qualité: 1) les cellules viables et sains préparés à partir des glandes surrénales; 2) PDL revêtement des lamelles couvre-objet; 3) la formation de joint de gigaohm; 4) le niveau de bruit du système; et 5) de correction de phase.

Pour la chirurgie des animaux, des modifications, on peut éventuellement faire est d'ajuster l'approche…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Poly-D-Lysine	Sigma	P0899
DMEM		15066024	Keep out of UV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Life Technologies
Cover Glass	Carolina Biological	633029	12mm
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140122	100mL
Insulin-Trans-Sel-X	Life Technologies	51500056	Only thaw on ICE!
Papain	Worthington	39S11614
EPC-7 plus patch amplifier	HEKA
BNC-2090 data acquisition board	National Instruments
Igor data acquisition software	Wavemetrics
P-97 pipette puller	Sutter Instruments
Microforge	Scientific Instruments
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instruments	B150-110-10	Outer diameter-1.5 mm
			Inner diameter 1.10 mm
			Length- 10 cm