Métodos de medidas de capacitância ligado por células em Rato Adrenal Cromafim celular

Summary

After exocytosis, fused plasma membrane is retrieved through a process known as endocytosis. This mechanism reforms new synaptic vesicles for the next round of release. Individual endocytic events are captured and analyzed through the use of the cell-attached capacitance recordings in mouse adrenal chromaffin cells.

Abstract

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion known as exocytosis that mediates synaptic transmission. Subsequent retrieval of synaptic vesicles is necessary to generate new neurotransmitter-filled vesicles in a process identified as endocytosis. During exocytosis, fusing vesicle membranes will result in an increase in surface area and subsequent endocytosis results in a decrease in the surface area. Here, our lab demonstrates a basic introduction to cell-attached capacitance recordings of single endocytic events in the mouse adrenal chromaffin cell. This type of electrical recording is useful for high-resolution recordings of exocytosis and endocytosis at the single vesicle level. While this technique can detect both vesicle exocytosis and endocytosis, the focus of our lab is vesicle endocytosis. Moreover, this technique allows us to analyze the kinetics of single endocytic events. Here the methods for mouse adrenal gland tissue dissection, chromaffin cell culture, basic cell-attached techniques, and subsequent examples of individual traces measuring singular endocytic event are described.

Introduction

A transmissão sináptica é mediada por exocitose de vesículas sinápticas contendo neurotransmissores e estas vesículas deve sofrer reciclagem endocítica local no terminal nervoso para manter a comunicação neuronal, a longo prazo. Dado o papel essencial da transmissão sináptica no cérebro, a compreensão do mecanismo molecular que constitui o ciclo de vesículas sinápticas é um fundamento essencial para uma melhor compreensão na comunicação celular como um todo. Entre os sistemas modelo de célula, a célula chromaffin adrenal tem proporcionado alguns dos insights mais definitivo na maquinaria molecular subjacente a reciclagem de vesículas sinápticas. Exocitose, o passo final na libertação de neurotransmissores, foi imensamente estudado e analisado por meio da utilização da célula cromafina adrenal ^1,2. Na verdade, a maioria dos jogadores moleculares que orquestram a formação, a segmentação de encaixe, e fusão de grânulos de secreção foram identificados devido à aplicação do divtécnicas erse em células cromafins ^1. Além disso, ao proporcionar uma oportunidade para permitir a resolução de um único vesícula da maquinaria proteína envolvida na exocitose, a célula cromafina continua a ser um poderoso modelo para resolver as questões de fusão das vesículas ^3.

Medições de capacitância-attached celulares foram utilizados pela primeira vez na resolução de fusão única vesícula durante exocitose ^3. Exocitose de vesículas pequenas como ~ 60 nm de diâmetro foram demonstrados para ser detectado por meio de medições de admissão da membrana celular com a técnica de patch-clamp na célula ligada configuração ^4-7. A admissão é definido como uma medida da facilidade com um circuito ou dispositivo irá permitir que um fluxo de corrente; que é o inverso da impedância. Assim, as medições de admissão de fornecer uma compreensão da capacitância da membrana. Isto é conseguido através da incorporação da membrana vesicular na membrana plasmática; essa incorporação revela mudanças na superfícieárea ^8. Cada vesícula fusão provoca um aumento gradual na capacitância de membrana ^9,10. Para além disso, esta medição de admissão proporciona a condutância da membrana e a condutância de poros de fusão durante um evento exocitótico ^3. Como essa técnica tem proporcionado uma ferramenta única de identificar cinética de um único vesícula durante exocitose, nosso laboratório foi recentemente aplicado esse conceito para detectar a endocitose de vesículas individuais ^11,12.

Nosso interesse específico é mediada por clatrina endocitose (CME), que tem sido considerada como um componente fundamental na arrumação muitas células ¹³ e como uma via principal para sináptica endocitose de vesículas nos terminais neuronais ^14,15. CME é conhecido por ser biologicamente importante, no entanto, sua cinética não ficar bem entendido devido a limitações técnicas no monitoramento de eventos endocíticas singulares. Dadas as semelhanças nos mecanismos exocíticos entre as células cromafins e neurônios ^1, é plausible que os mecanismos de fissão em células cromafins, provavelmente, pode aplicar-se a vesícula sináptica endocitose em neurônios. As medidas de capacitância ligado de células foram utilizadas para monitorar eventos endocíticas individuais e analisar a cinética de fissão, que a maioria dos métodos não são capazes de resolver. Nas nossas gravações ligado de células, uma onda sinusoidal de 20 kHz é sobreposta sobre o potencial de manutenção, e a corrente de saída é separado a condutância da membrana em um canal e a capacitância da membrana no outro canal a partir de uma de duas fases amplificador lock-in ^{16 18.} A partir das alterações na condutância da membrana e capacitância, pode calcular-se a cinética da cisão de poros, o que provavelmente corresponde ao gargalo da membrana tubular que liga a vesícula internalização da membrana do plasma antes da vesícula pinch-off. Coletivamente, essa técnica dá-nos a oportunidade de examinar os mecanismos de regulação da vesícula fissão durante CME.

Protocol

NOTA: Todo o procedimento foi realizado de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde, aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso da Universidade de Illinois, em Chicago Animal. 1. Soluções e Meios de Cultura Preparações Mantenha todas as soluções a -20 ° C durante até seis meses. Mantenha o meio de cultura, a 4 ° C por até 3 meses. Preparar 100 ml de meio de cultura por mistura de 1 ml de solução pen-strep e 1 ml de ITSX (insulina-transferrina-…

Representative Results

A viabilidade celular e a qualidade da vedação gigaohm são críticos na determinação da qualidade das gravações capacitância ligado de células. Portanto, é essencial para obter uma cultura de células eficazes e eficientes antes de registos electrofisiolicos, e células viáveis ​​típicas são ilustradas na Figura 1. Prática e tempo será útil na obtenção de uma vedação gigaohm com alta qualidade. Se se pode ver claramente a deformação da célula quando a pipeta patch for aproxima…

Discussion

Medições de capacitância anexado-Cell exigir várias etapas críticas, a fim de obter sucesso gravações com alta qualidade: 1) células viáveis ​​e saudáveis ​​preparados a partir de glândulas supra-renais; 2) PDL revestimento das lamelas; 3) de formação de selo gigaohm; 4) o nível de ruído do sistema; e 5) correção de fase.

Para a cirurgia animal, modificações pode potencialmente fazer é ajustar a abordagem cirúrgica para melhor atender destreza e para evitar danos…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Poly-D-Lysine	Sigma	P0899
DMEM		15066024	Keep out of UV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Life Technologies
Cover Glass	Carolina Biological	633029	12mm
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140122	100mL
Insulin-Trans-Sel-X	Life Technologies	51500056	Only thaw on ICE!
Papain	Worthington	39S11614
EPC-7 plus patch amplifier	HEKA
BNC-2090 data acquisition board	National Instruments
Igor data acquisition software	Wavemetrics
P-97 pipette puller	Sutter Instruments
Microforge	Scientific Instruments
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instruments	B150-110-10	Outer diameter-1.5 mm
			Inner diameter 1.10 mm
			Length- 10 cm