Крупномасштабная очистка свинины или крупного рогатого скота наружных сегментов фоторецепторов фагоцитоза Анализы на эпителиальных пигментных клеток сетчатки
Summary
This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 °C.
Abstract
Анализ одной из жизненно важных функций пигментного эпителия (РПЭ) клеток, фагоцитоз, проведенных в возрасте дистальных фрагментов наружных сегментов фоторецепторов (POS) могут быть выполнены в пробирке. Наружных сегментов фоторецепторов с магазином мембранных дисков, содержащих фототрансдукции машины постоянно обновляются в сетчатке. Отработанные POS устраняются ежедневно клетках ПЭС. Грызунов, свиней / крупного рогатого скота и клетки ПЭС человека признают POS из различных видов аналогичным образом. Для облегчения выполнения большую серию экспериментов с небольшой изменчивостью, большой запас POS может быть выделен из свиных глаз и хранили в аликвотах замораживали. Этот протокол использует преимущества характеристики фотопигментов, которые отображают оранжевый цвет при хранении в темноте. При слабом красном свете, сетчатки собираются в буфере из открытых наглазниками вырезанных пополам. Сетчатки суспензию клеток гомогенизируют, фильтровали и загружали в непрерывном градиенте сахарозы. После CENtrifugation, POS расположены в дискретной полосы в верхней части градиента, который имеет характерный оранжевый цвет. POS затем собирали, центрифугировали, ресуспендировали последовательно в промывных буферах, подсчитывали и аликвоты. POS, полученные таким образом, могут быть использованы для фагоцитоза анализов и анализа активации протеина, локализации или взаимодействия в различные моменты времени после POS вызов. Кроме того, POS могут быть помечены флуорофорами, адрес. Г., FITC, перед аликвоты для последующего флуоресценции количественного POS связывания или охвате. Другие возможные области применения включают использование модифицированных POS или POS вызов в сочетании с стрессовых условиях изучить влияние окислительного стресса или старения на клетках ПЭС.
Introduction
В сетчатке, зрение вызвано изомеризации фоточувствительных молекул, называемых опсины, прежде чем преобразован в сигнал, который может быть передан между нейронами до визуальных областей мозга. Эти молекулы встраиваются в штабеля мембранных дисков, напоминающих блины, которые составляют наружный сегмент части клетки фоторецепторов (PRS). Подвергаясь постоянным воздействием света, и поэтому значительного уровня окислительного стресса, ОР постоянно обновлять свои наружные сегменты, чтобы ограничить потенциальный ущерб окислительный. Наружных сегментов фоторецепторов находятся в тесном контакте с апикальной микроворсинки соседних пигментного эпителия (РПЭ) клеток. Клетки ПЭС составляют внешнюю часть крови сетчатки барьер и обеспечить многочисленные задачи, которые имеют решающее значение для здоровья и функции 1 фоторецепторов, такие как тушение световые лучи с помощью меланина пигментов, повторное изомеризации фотореакционноспособной опсин компонентов сетчатки глаза, обеспечивая питательными веществами и гrowth факторов, участвующих в распоряжении PR метаболита.
Кроме того, клетки ПЭС устраняют провел POS и перерабатывать их компоненты, ежедневный занятие, которое регулируется циркадного ритма в сетчатке млекопитающих 2,3. Оформление пролитой POS является абсолютно необходимым для выживания PR. Когда он полностью отменены, POS мусору скапливаться и ОР вырождаться приводит к быстрому 4,5 потере зрения. Если ритмическая профиль теряется и заменяется постоянной деятельности, PR и ПЭС при накоплении дефектов с возрастом 6. Таким образом, очень важно, чтобы охарактеризовать молекул рный регулирование НПП фагоцитоза в пробирке, чтобы понять, фенотипы, связанные с ее дисфункции. Интересно, что молекулярные машины в клетках ПЭС очень похож на тот, используемой для очистки макрофагов апоптотических клеток, и оба зависят от признания открытой фосфатидилсерина на фагоцитарную мусора 7-9. Тем не менее, ПЭС клетки и макрофаги регулируют рНagocytosis иначе, как макрофаги выбрать для немедленного устранения апоптоза клеток во время столкновения, а клетки ПЭС ритмично поглотить POS только один раз в день, несмотря на их постоянном контакте с наружным сегментам. Это говорит о том специфические механизмы регуляции, которые еще не полностью изучены.
Многие из молекул, вовлеченных в НПП фагоцитарной техники были идентифицированы или проверены благодаря использованию выделенной POS и клеточных культур фагоцитоза анализов. Рецепторов alphavbeta5 интегрину расположен в НПП поверхности верхней клетки, в координации с его лигандом MFG-E8, специфически связывается с POS 10-12, которые затем интернализованного через MerTK тирозинкиназы рецептора 13-15. Поглотитель рецептора CD36, как было показано участие в приеме POS и влиять на его скорость 16,17, и может служить в качестве датчика окисленных фосфолипидов на поверхности POS 18. Интернационализация нуждается в наем F-актина цитоскелета задницуociated белки, такие как аннексин 2 19, миозина II 20 и миозина VIIA 21,22. Родной или окисляется POS в пробирке также используются для понимания старения фенотипы клеток RPE в естественных условиях, связанных с накоплением плохо усваиваются окисленного POS 23-28. Поколение ПЭС клеток, полученных из стволовых клеток инициировал новое приложение для изолированной POS, которые используются, чтобы доказать, функциональность клеток, прежде чем они пересаживаются на животных или больных 29,30,27.
Впервые описан Molday и коллег в 1987 году 31, протокол для выделения крупного рогатого скота POS сочетает в себе ультрацентрифуги шаг сетчатки гомогенатах непрерывных градиентов сахарозы с соблюдением характерной оранжевой появления небеленой сетчатки фотопигментом (балансовой 11- цис сетчатки). В последние 10 лет в связи с мерами предосторожности, принятых в целях сведения к минимуму риска коровьего бешенства, использование свиных глазах стала increasingly заметным. Протокол, описанный здесь, показывает, как получить большое количество POS из свиной или бычий глаз, которые могут быть аликвоты и хранили в течение длительных периодов времени. Это устраняет необходимость подготовки POS от грызунов глазами, что требует использования большого количества животных в подготовке POS и анализа 32,33,21,22. Кроме того, сведения о POS маркировки перед хранением с использованием флуоресцентных молекул даны, чтобы количественно и визуализировать POS в упрощенном и сопоставимым образом для некоторых приложений по сравнению с маркировки POS после фагоцитоза анализа 32,10. Таким образом, эти большие запасы позволяют воспроизводимости и легкости в использовании во многих различных типах опытов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Три шага или условий имеют решающее значение для оптимизации очистки: качество градиента литья и тонкий градиент трубы манипуляции, сохраняя ткани охлаждают и в темноте до стадии сбора, сила встряхивания сетчатки гомогенатах, чтобы получить надлежащую изоляцию POS от остальной части П?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным агентством де-ла-Recherche (JEUNES Chercheuses / Jeunes Chercheurs к EFN), Фонд Воир и др Entendre и Fondation Бетанкур Schueller (молодого исследователя Гранты для EFN), Национальный центр научных исследований (CNRS, постоянное место для EFN) и Национальный институт глаз из Национальных институтов здравоохранения (R01-EY13295 в SCF). Кроме того, Институт де ла Видение финансируется Национальным институтом де-ла-Santé и др де-ла-Recherche MEDICALE, Университет Пьера и Марии Кюри-Париж 6, Национальный центр научных исследований и отдела Парижа.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Specific Material/Equipment | |||
| 2-chamber gradient maker | gradient maker with 30-ml chambers | ||
| 3-mm diameter silicone tubing | tubing for gradient casting | ||
| small size magnetic stir bar | stir bar fitting the gradient maker chamber | ||
| red safelight lamp | inactinic lamp for dissection in the dark | ||
| Ultra Clear 25×89 cm tubes | Beckman | 344058 | ultracentrifugation tubes |
| PP Oak Ridge tubes | Nalgene | 3119-0050 | 30-mL centrifugation tubes |
| Optima LE-80K | Beckman Coulter | 365668 | ultracentrifuge |
| SW 32Ti swing rotor | Beckman Coulter | 369694 | swing rotor for ultracentrifuge |
| Avanti J-26 XP | Beckman Coulter | 393124 | centrifuge |
| JA-25.50 rotor | Beckman Coulter | 363058 | rotor for Avanti J-26 XP centrifuge |
| FITC Isomer I | Life Technologies | F-1906 | fluorescent dye |
| Other Material/Equipment | |||
| counting chamber (such as Neubauer or Malassez) | |||
| dark ice buckets with lids | |||
| scales | |||
| magnetic stirrer and upholding pole | |||
| refrigated microcentrifuge | |||
| 37 °C water bath | |||
| -80 °C freezer | |||
| Consumables | |||
| labcoat | Health and safety | ||
| gloves | |||
| sleeve protectors | |||
| googles | |||
| absorbent pads | |||
| biohazard trash bags and bins | |||
| Weck-Prep blades (60-mm/2.25-in wide razor blades) | Dissection | ||
| 15-cm plastic dish | |||
| sterile gauze sheets | |||
| 15- and 50-mL tubes | Common consumables | ||
| microtubes | |||
| aluminum foil | |||
Riferimenti
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol. Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
- Young, R. W., Bok, D. Participation of the retinal pigment epithelium in the rod outer segment renewal process. J. Cell Biol. 42 (2), 392-403 (1969).
- LaVail, M. M. Rod outer segment disk shedding in rat retina: relationship to cyclic lighting. Science. 194 (4269), 1071-1074 (1976).
- Mullen, R. J., LaVail, M. M. Inherited retinal dystrophy: primary defect in pigment epithelium determined with experimental rat chimeras. Science. 192 (4241), 799-801 (1976).
- Nandrot, E., et al. Homozygous deletion in the coding sequence of the c-mer gene in RCS rats unravels general mechanisms of physiological cell adhesion and apoptosis. Neurobiol. Dis. 7 (6 pt B), 586-599 (2000).
- Nandrot, E. F., Kim, Y., Brodie, S. E., Huang, X., Sheppard, D., Finnemann, S. C. Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking alphavbeta5 integrin. J. Exp. Med. 200 (12), 1539-1545 (2004).
- Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. Macrophage and retinal pigment epithelium phagocytosis: apoptotic cells and photoreceptors compete for alphavbeta3 and alphavbeta5 integrins, and protein kinase C regulates alphavbeta5 binding and cytoskeletal linkage. J. Exp. Med. 190 (6), 861-874 (1999).
- Savill, J., Dransfield, I., Hogg, N., Haslett, C. Vitronectin receptor-mediated phagocytosis of cells undergoing apoptosis. Nature. 343 (6254), 170-173 (1990).
- Ruggiero, L., Connor, M. P., Chen, J., Langen, R., Diurnal Finnemann, S. C. localized exposure of phosphatidylserine by rod outer segment tips in wild-type but not Itgb5-/- or Mfge8-/- mouse retina. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (21), 8145-8148 (2012).
- Finnemann, S. C., Bonilha, V. L., Marmorstein, A. D., Rodriguez-Boulan, E. Phagocytosis of rod outer segments by retinal pigment epithelial cells requires alphavbeta5 integrin for binding but not for internalization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94 (24), 12932-12937 (1997).
- Lin, H., Clegg, D. O. Integrin alphavbeta5 participates in the binding of photoreceptor rod outer segments during phagocytosis by cultured human retinal pigment epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39 (9), 1703-1712 (1998).
- Nandrot, E. F., Anand, M., Almeida, D., Atabai, K., Sheppard, D., Finnemann, S. C. Essential role for MFG-E8 as ligand for alphavbeta5 integrin in diurnal retinal phagocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (29), 12005-12010 (2007).
- Feng, W., Yasumura, D., Matthes, M. T., LaVail, M. M., Vollrath, D. Mertk triggers uptake of photoreceptor outer segments during phagocytosis by cultured retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 277 (19), 17016-17022 (2002).
- Finnemann, S. C. Focal adhesion kinase signaling promotes phagocytosis of integrin-bound photoreceptors. EMBO J. 22 (16), 4143-4154 (2003).
- Nandrot, E. F., Silva, K. E., Scelfo, C., Finnemann, S. C. Retinal pigment epithelial cells use a MerTK-dependent mechanism to limit the phagocytic particle binding activity of αvβ5 integrin. Biol. Cell. 104 (6), 326-341 (2012).
- Ryeom, S. W., Sparrow, J. R., Silverstein, R. L. CD36 participates in the phagocytosis of rod outer segments by retinal pigment epithelium. J. Cell Sci. 109 (2), 387-395 (1996).
- Finnemann, S. C., Silverstein, R. L. Differential roles of CD36 and alphavbeta5 integrin in photoreceptor phagocytosis by the retinal pigment epithelium. J. Exp. Med. 194 (9), 1289-1298 (2001).
- Sun, M., et al. Light-induced oxidation of photoreceptor outer segment phospholipids generates ligands for CD36-mediated phagocytosis by retinal pigment epithelium: a potential mechanism for modulating outer segment phagocytosis under oxidant stress conditions. J. Biol. Chem. 281 (7), 4222-4230 (2006).
- Law, A. L., et al. Annexin A2 regulates phagocytosis of photoreceptor outer segments in the mouse retina. Mol. Biol. Cell. 20 (17), 3896-3904 (2009).
- Strick, D. J., Feng, W., Vollrath, D. Mertk drives myosin II redistribution during retinal pigment epithelial phagocytosis. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50 (5), 2427-2435 (2009).
- Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (11), 6481-6486 (2003).
- Gibbs, D., Diemer, T., Khanobdee, K., Hu, J., Bok, D., Williams, D. S. Function of MYO7A in the human RPE and the validity of shaker1 mice as a model for Usher syndrome 1B. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51 (2), 1130-1135 (2010).
- Kennedy, C. J., Rakoczy, P. E., Constable, I. J. Lipofuscin of the retinal pigment epithelium: a review. Eye (Lond.). 9 (Pt 6), 763-771 (1995).
- Finnemann, S. C., Leung, L. W., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin component A2E selectively inhibits phagolysosomal degradation of photoreceptor phospholipid by the retinal pigment epithelium). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (6), 3842-3847 (2002).
- Sugano, E., Tomita, H., Ishiguro, S., Isago, H., Tamai, M. Nitric oxide-induced accumulation of lipofuscin-like materials is caused by inhibition of cathepsin. S. Curr. Eye Res. 31 (7-8), 607-616 (2006).
- Vives-Bauza, C., et al. The age lipid A2E and mitochondrial dysfunction synergistically impair phagocytosis by retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 283 (36), 24770-24780 (2008).
- Singh, R., et al. Functional analysis of serially expanded human iPS cell-derived RPE cultures. Invest. Ophthalmol. Vis Sci. 54 (10), 6767-6778 (2013).
- Lei, L., Tzekov, R., McDowell, J. H., Smith, W. C., Tang, S., Kaushal, S. Formation of lipofuscin-like material in the RPE Cell by different components of rod outer segments. Exp. Eye Res. 112, 57-67 (2013).
- Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), 8152 (2009).
- Lustremant, C., et al. Human induced pluripotent stem cells reveal early developmental molecular correlates with a probable Leber congenital amaurosis type I. Cell. Reprogram. 15 (3), 233-246 (2013).
- Molday, R. S., Hicks, D., Peripherin Molday, L. A rim-specific membrane protein of rod outer segment discs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 28 (1), 50-61 (1987).
- Chaitin, M. H., Hall, M. O. Defective ingestion of rod outer segments by cultured dystrophic rat pigment epithelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 24 (7), 812-820 (1983).
- Tsang, S. H., et al. Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo. Science. 282 (5386), 117-121 (1998).
- Carr, A. J., et al. Molecular characterization and functional analysis of phagocytosis by human embryonic stem cell-derived RPE cells using a novel human retinal assay. Mol. Vis. 15, 283-295 (2009).
- Dun, Y., Vargas, J., Brot, N., Finnemann, S. C. Independent roles of methionine sulfoxide reductase A in mitochondrial ATP synthesis and as antioxidant in retinal pigment epithelial cells. Free Radic. Biol. Med. 65, 1340-1351 (2013).
- Xu, Y. T., Wang, Y., Chen, P., Xu, H. F. Age-related maculopathy susceptibility 2 participates in the phagocytosis functions of the retinal pigment epithelium. Int. J. Ophthalmol. 5 (2), 125-132 (2012).
- Mao, Y., Finnemann, S. C. Essential diurnal Rac1 activation during retinal phagocytosis requires αvβ5 integrin but not tyrosine kinases focal adhesion kinase or Mer tyrosine kinase. Mol. Biol. Cell. 23 (6), 1104-1114 (2013).
- Mao, Y., Finnemann, S. C. Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture. Methods Mol. Biol. 935, 285-295 (2013).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: Use and utility of RPE cells in culture. Exp Eye Res. 126, 51-60 (2014).
- Hall, M. O., Abrams, T. Kinetic studies of rod outer segment binding and ingestion by cultured rat RPE cells. Exp. Eye Res. 45 (6), 907-922 (1987).
- Bulloj, A., Duan, W., Finnemann, S. C. PI 3-kinase independent role for AKT in F-actin regulation during outer segment phagocytosis by RPE cells. Exp. Eye Res. 113, 9-18 (2013).
- Chowers, I., et al. Changes in retinal pigment epithelial gene expression induced by rod outer segment uptake. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45 (7), 2098-2106 (2004).
- Edwards, R. B., Szamier, R. B. Defective phagocytosis of isolated rod outer segments by RCS rat retinal pigment epithelium in culture. Science. 197 (4307), 1001-1003 (1977).
- Philp, N. J., Bernstein, M. H. Phagocytosis by retinal pigment epithelium explants in culture. Exp. Eye Res. 33 (1), 47-53 (1981).
- Burstyn-Cohen, T., Lew, E. D., Través, P. G., Burrola, P. G., Hash, J. C., Lemke, G. Genetic dissection of TAM receptor-ligand interaction in retinal pigment epithelial cell phagocytosis. Neuron. 76 (6), 1123-1132 (2012).
