A gran escala de purificación de porcino o bovino fotorreceptor Outer Segmentos para Fagocitosis ensayos sobre células pigmento retiniano epitelial
Summary
This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 °C.
Abstract
Análisis de una de las funciones vitales de las células del epitelio pigmentario de la retina (RPE), la fagocitosis de gastados fragmentos distales de edad de los segmentos externos de los fotorreceptores (POS) se puede realizar in vitro. Fotorreceptoras segmentos externos con pilas de discos membranosas que contienen la maquinaria fototransducción se renuevan de forma continua en la retina. POS gastados se eliminan diariamente por células del RPE. Roedor, porcino / bovino y células del RPE humanos reconocen POS de diversas especies de una manera similar. Para facilitar la realización de grandes series de experimentos con poca variabilidad, con un amplio stock de POS puede aislarse de ojos porcinos y se almacena congelado en alícuotas. Este protocolo se aprovecha de la característica de fotopigmentos que muestran un color anaranjado cuando se mantienen en la oscuridad. Bajo una luz roja tenue, retinas se recogen en un buffer de ojeras abiertas cortadas en mitades. La suspensión de células de la retina se homogeneiza, se filtró y se cargó en un gradiente de sacarosa continuo. Después centrifugation, POS se encuentran en una banda discreta en la parte superior del gradiente que tiene un color naranja característico. POS se recogen, hilar, volvieron a suspender de forma secuencial en tampones de lavado, se contaron y se dividen en partes alícuotas. POS obtenidos de esta manera se pueden utilizar para ensayos de fagocitosis y análisis de activación de la proteína, la localización o la interacción en diversos momentos después de la exposición POS. Alternativamente, POS puede marcarse con fluoróforos, e. G., FITC, antes de alícuotas para la posterior cuantificación de fluorescencia de POS de unión o inmersión. Otras posibles aplicaciones incluyen el uso de desafío POS POS modificado o combinado con condiciones de estrés para estudiar el efecto del estrés oxidativo o envejecimiento en las células RPE.
Introduction
En la retina, la visión se activa por isomerización de moléculas fotosensibles llamadas opsinas, antes de ser transformada en una señal que puede ser transmitida entre las neuronas hasta las áreas visuales del cerebro. Estas moléculas están incrustados en las pilas de discos membranosos asemejan panqueques que constituyen las porciones de segmentos externos de las células fotorreceptoras (RP). Ser sometido a la exposición constante a la luz y por lo tanto los niveles considerables de estrés oxidativo, RP renovar continuamente sus segmentos externos para limitar el daño oxidativo potencial. Segmentos externos de los fotorreceptores están en estrecho contacto con microvellosidades apicales de las células vecinas del epitelio pigmentario de la retina (RPE). RPE células constituyen la parte exterior de la barrera hemato-retiniana y aseguran numerosas tareas que son cruciales para la salud y la función de los fotorreceptores 1, tales como apagar los rayos de luz a través de pigmentos de melanina, re-isomerización de la retina componente opsina fotoreactivo, proporcionando nutrientes y grecimiento factores, participando en disposición PR metabolito.
Además, las células RPE eliminan pasaron POS y reciclan sus componentes, una ocupación diaria que está regulado por el ritmo circadiano en la retina de mamíferos 2,3. El aclaramiento de cobertizo POS es absolutamente necesario para la supervivencia de relaciones públicas. Cuando esté completamente abrogada, POS se acumulan escombros y RP degeneran causando una rápida 4,5 pérdida de visión. Si el perfil rítmico se pierde y se sustituye por una actividad constante, PR y RPE defectos se acumulan con la edad 6. Por lo tanto, es muy importante para caracterizar la regulación molecular de la fagocitosis RPE in vitro con el fin de entender fenotipos vinculados a su disfunción. Curiosamente, la maquinaria molecular en las células RPE es muy similar a la utilizada por los macrófagos para eliminar las células apoptóticas y ambos son dependientes de reconocimiento de fosfatidilserina expuesta sobre los desechos fagocítica 7-9. Sin embargo, las células RPE y macrófagos regular el pHagocytosis diferente, como macrófagos optan por la eliminación inmediata de las células apoptóticas en tiempo de encuentro, mientras que las células del EPR rítmicamente engullir POS sólo una vez al día a pesar de su permanente contacto con los segmentos externos. Esto sugiere mecanismos de regulación específicos que aún no se entienden completamente.
Muchas de las moléculas implicadas en la maquinaria fagocítica RPE han sido identificados o validado gracias a la utilización de POS aislado y ensayos de fagocitosis de cultivo celular. El receptor de la integrina alphavbeta5 situado en la superficie celular apical RPE, en coordinación con su ligando MFG-E8, se une específicamente a POS 10-12, que luego se internaliza a través del receptor quinasa de tirosina MerTK 13-15. El receptor scavenger CD36 se ha demostrado que participar en la ingesta de POS e influir en su velocidad de 16,17, y puede servir como un sensor de fosfolípidos oxidados en la superficie POS 18. Internalización necesita la contratación de F-actina del citoesqueleto-culoociated proteínas tales como la anexina 2 19, miosina II 20 y la miosina VIIA 21,22. POS o nativa oxidada in vitro también se utilizan para entender el envejecimiento de fenotipos de células del EPR en vivo vinculados a la acumulación de mal digerido POS oxidado 23-28. La generación de células del EPR derivadas de células madre ha iniciado una nueva aplicación para el aislado POS que se utilizan para probar la funcionalidad de las células antes de que se trasplantan a animales o pacientes 29,30,27.
En primer lugar se describe por Molday y sus colegas en 1987 31, el protocolo para el aislamiento de POS bovina combina una etapa de ultracentrifugación de los homogeneizados de la retina en gradientes de sacarosa continuas con la observación del aspecto de color naranja característico de fotopigmento retinal crudos (llevar 11- cis retinal). En los últimos 10 años, debido a las precauciones tomadas para minimizar el riesgo de la enfermedad de las vacas locas, el uso de ojos porcinos se ha convertido en increasingly prominente. El protocolo descrito aquí muestra cómo obtener grandes cantidades de POS de porcino o de los ojos de la especie bovina que se pueden alícuotas y se almacenan durante periodos prolongados de tiempo. Esto elimina la necesidad de preparar POS de los ojos de roedores, que requiere el uso de un gran número de animales por la preparación y ensayo de POS 32,33,21,22. Además, se dan detalles sobre el etiquetado POS antes de su almacenamiento utilizando moléculas fluorescentes, para cuantificar y visualizar POS de una manera simplificada y comparable para algunas aplicaciones en comparación con POS etiquetado después de que el ensayo de la fagocitosis de 32,10. Por lo tanto, estas grandes stocks permiten reproducibilidad y facilidad de uso en muchos tipos diferentes de experimentos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tres pasos o condiciones son cruciales para una purificación optimizada: la calidad de la fundición de gradiente y delicada manipulación de tubos de gradiente, manteniendo los tejidos refrigerada y en la oscuridad hasta la etapa de recogida, la fuerza de agitación de homogeneizados de la retina para obtener el aislamiento POS adecuada del resto de la PR célula. Si surge algún problema en ver a la banda naranja correctamente, son muy probablemente debido a una de las tres razones anteriores (véase también el segu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Agence Nationale de la Recherche (Jeunes Chercheuses / Jeunes Chercheurs a EFN), Fondation Voir et Entendre y Fondation Bettencourt Schueller (Becas a Jóvenes Investigadores a EFN), Centro Nacional de la Recherche Scientifique (CNRS, puesto permanente para EFN) , y el Instituto Nacional del Ojo de los Institutos Nacionales de Salud (R01-EY13295 a SCF). Además, el Instituto de la Visión es financiado por el Institut National de la Santé et de la Investigación Médica, Universidad Pierre et Marie Curie en París 6, Centro Nacional de la Investigación Científica y el departamento de París.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Specific Material/Equipment | |||
| 2-chamber gradient maker | gradient maker with 30-ml chambers | ||
| 3-mm diameter silicone tubing | tubing for gradient casting | ||
| small size magnetic stir bar | stir bar fitting the gradient maker chamber | ||
| red safelight lamp | inactinic lamp for dissection in the dark | ||
| Ultra Clear 25×89 cm tubes | Beckman | 344058 | ultracentrifugation tubes |
| PP Oak Ridge tubes | Nalgene | 3119-0050 | 30-mL centrifugation tubes |
| Optima LE-80K | Beckman Coulter | 365668 | ultracentrifuge |
| SW 32Ti swing rotor | Beckman Coulter | 369694 | swing rotor for ultracentrifuge |
| Avanti J-26 XP | Beckman Coulter | 393124 | centrifuge |
| JA-25.50 rotor | Beckman Coulter | 363058 | rotor for Avanti J-26 XP centrifuge |
| FITC Isomer I | Life Technologies | F-1906 | fluorescent dye |
| Other Material/Equipment | |||
| counting chamber (such as Neubauer or Malassez) | |||
| dark ice buckets with lids | |||
| scales | |||
| magnetic stirrer and upholding pole | |||
| refrigated microcentrifuge | |||
| 37 °C water bath | |||
| -80 °C freezer | |||
| Consumables | |||
| labcoat | Health and safety | ||
| gloves | |||
| sleeve protectors | |||
| googles | |||
| absorbent pads | |||
| biohazard trash bags and bins | |||
| Weck-Prep blades (60-mm/2.25-in wide razor blades) | Dissection | ||
| 15-cm plastic dish | |||
| sterile gauze sheets | |||
| 15- and 50-mL tubes | Common consumables | ||
| microtubes | |||
| aluminum foil | |||
Riferimenti
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